| In-Fusion Cloning：高效的單片段和多片段克隆方法 |
| 【數(shù)據(jù)提供】Dr. Samuel Bru Postdoc, Orphan Cyclins Group Universitat Internacional de Catalunya |
| 【實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介】 |
| Dr. Josep Clotet課題組的Dr. Samuel Bru及其同事定期從釀酒酵母中純化重組嵌合蛋白質(zhì)；該小組試圖尋找一種快速、簡(jiǎn)便的方法來(lái)克隆其工作所需的嵌合蛋白質(zhì)。在這項(xiàng)研究中，使用了In-Fusion克隆和基于連接酶的克隆兩種方法來(lái)平行測(cè)試克隆單個(gè)和多個(gè)插入片段的效果，分別克隆一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)插入片段。通過(guò)限制酶消化篩選菌落，克隆效率為從10個(gè)隨機(jī)選擇的菌落中獲得的陽(yáng)性克隆的數(shù)量，在5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中取平均值。 |
| 通過(guò)直接比較兩種克隆方法的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)由于傳統(tǒng)T4 DNA連接酶的克隆方法效率低，一步法克隆多片段是非常困難的。然而，當(dāng)用In-Fusion克隆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，該方法對(duì)于單片段插入和多片段插入反應(yīng)都是高效的，并且在較短的時(shí)間內(nèi)完成，操作步驟也更少。 |
| 【用戶感言】 |
| “總之，與傳統(tǒng)的基于連接酶的克隆方法相比，無(wú)論單片段還是多片段克隆，In-Fusion HD克隆試劑盒都為我們提供了更高的克隆效率和更快的結(jié)果。” -Dr. Samuel Bru |
| 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 |
| 對(duì)于In-Fusion克隆，設(shè)計(jì)引物使插入片段具有與相鄰DNA片段重疊的末端（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間，參見(jiàn)圖1）。對(duì)于連接酶的克隆方法，設(shè)計(jì)插入片段與相鄰片段具有相容的限制酶位點(diǎn)（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間。所有插入片段都需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，但使用連接酶方法時(shí)，插入片段在克隆前需要用合適的限制酶進(jìn)行消化。 對(duì)每種克隆方法都設(shè)置了一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)插入片段的克隆反應(yīng)（參見(jiàn)圖1和圖2），設(shè)計(jì)克隆兩個(gè)和三個(gè)插入片段的反應(yīng)時(shí)，所有DNA片段是一步法克隆到表達(dá)載體中。在所有實(shí)驗(yàn)中，最終質(zhì)粒均為~6.8 kb。通過(guò)限制酶消化鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，從10個(gè)隨機(jī)選擇的克隆中陽(yáng)性克隆的數(shù)量取平均數(shù)以確定克隆效率（圖2）。 In-Fusion克隆在所有測(cè)試條件下都是成功的，單個(gè)和多個(gè)插入片段實(shí)驗(yàn)都可以得到高克隆效率。相比之下，連接酶方法克隆效率較低，特別是多片段克隆反應(yīng)。 |
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| 圖1. 使用In-Fusion克隆和基于T4 DNA連接酶的方法進(jìn)行單片段和多片段克隆反應(yīng)的示意圖。插入片段以線性形式顯示; 載體以環(huán)形顯示。In-Fusion克隆所需的相鄰DNA片段（插入片段和載體之間或插入片段與片段之間）之間的15 bp重疊以不同的顏色顯示。在傳統(tǒng)連接酶方法的情況下，顏色代表不同的粘性末端。 |
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| 圖2. 使用In-Fusion克隆和基于連接酶的克隆方法進(jìn)行單片段和多片段克隆反應(yīng)的克隆效率定量比較。圖A.所有三種克隆反應(yīng)類型的平均克隆效率的柱型圖。結(jié)果對(duì)應(yīng)于五個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。星號(hào)表示使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算的顯著差異，***表示p值<0.0005。 圖B.對(duì)于五個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)列出了克隆效率，并且列出了每種克隆反應(yīng)類型的平均效率。 |
| 【結(jié)論】 |
| In-Fusion技術(shù)在單片段插入和多片段插入克隆實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果均優(yōu)于傳統(tǒng)的基于連接酶的克隆方法。雖然連接酶方法對(duì)單片段插入的克隆效率為76％，但多片段克隆的效率顯著下降，兩個(gè)和三個(gè)片段克隆反應(yīng)效率分別為2％和0％。相比之下，In-Fusion克隆對(duì)于單片段克隆的效率為96％，并且對(duì)于雙片段和三片段克隆也顯示出良好的克隆效率，分別為78％和42％?？傮w而言，就效率、步驟數(shù)和所有三種反應(yīng)類型的處理時(shí)間而言，In-Fusion技術(shù)被證明是一種更簡(jiǎn)單、更快速的克隆方法。 |
| 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法和步驟請(qǐng)見(jiàn)： |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/single-and-multiple-insert-cloning |
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