| In-Fusion Cloning：成功地直接克隆大的表達載體 | |
| 【數(shù)據(jù)提供】Ansul Lokdarshi Graduate Research Assistant, University of Knoxville, TN |
|
| 【實驗簡介】 | |
| 下面實驗中使用了In-Fusion Cloning構(gòu)建植物中YFP標簽蛋白質(zhì)定位研究的正對照載體。無需傳統(tǒng)連接方法的亞克隆操作，我們直接將黃色熒光蛋白質(zhì)（YEP）克隆到一個植物雙向載體上，啟動子為花椰菜花葉病毒雙35S啟動子（CaMV D35S）。通過限制酶酶切和測序來篩選確認陽性克隆。從實驗設(shè)計到完成、確認克隆，整體時間比連接酶的方法少了兩天。 | |
| 【結(jié)果】 | |
| PCR擴增獲得包含目標載體5’和3’末端序列的插入片段（圖1），PCR生成了一個單一的清晰的正確大小條帶（圖2左側(cè)）。利用In-Fusion酶將插入片段克隆到線性表達載體上，檢測3個克隆均為陽性克隆，對其中一個克隆通過限制酶作圖確認（圖2右側(cè)）。最終構(gòu)建的質(zhì)粒長度約9.5 kb，一次克隆實驗即成功了。 | |
 |
圖1.構(gòu)建后的載體圖示。最終的載體是一個表達載體，用于植物研究，YFP與D35S啟動子在同一閱讀框中 |
 |
|
| 圖2. 得到了單一清晰條帶，并以100%的準確率克隆至線性載體上。左圖，插入片段的PCR擴增結(jié)果。使用CloneAmp HiFi PCR premix擴增了YFP（740 bp）片段。引物引入了適用于In-Fusion克隆的5'-和 3'-末端。右圖，構(gòu)建質(zhì)粒用限制酶消化后的電泳圖。使用Nco I 和Xba I酶切質(zhì)粒，得到與預期大小一致的條帶。 | |
| 【結(jié)論】 | |
| In-Fusion Cloning僅通過一次克隆實驗，即完成了陽性表達載體的構(gòu)建，達到了100%的成功率。不需要亞克隆，從實驗設(shè)計到完成確認比傳統(tǒng)連接酶的方法減少了兩天。 | |
| 詳細實驗方法和步驟請見： | |
| https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/direct-cloning-into-large-vectors | |
京公網(wǎng)安備 110114000405號