| Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System |
| 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應(yīng)合成的 mRNA產(chǎn)量和 mRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 |
 A．使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)時(shí)RNA的產(chǎn)量  B．使用CleanCap Reagent AG (3' OMe)合成的FLuc mRNA在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá) |
| A) 分別在 IVT反應(yīng)液中加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情況下，合成Firefly luciferase (螢火蟲熒光素酶 ,FLuc) mRNA的產(chǎn)量。由此可見(jiàn)，使用 CleanCap對(duì)合成的RNA產(chǎn)量沒(méi)有影響。 B) 使用 TransIT-mRNA轉(zhuǎn)染試劑盒（Code No. MIR2225/MIR2250/MIR2255/MIR2256）將A中獲得的 0.5 μg RNA轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中。24小時(shí)后，收集細(xì)胞并測(cè)定FLuc的活性，結(jié)果表明，含有CleanCap的IVT反應(yīng)液合成的FLuc mRNA與市面上銷售的FLuc mRNA positive control具有相同的活性。另一方面，在未加入CleanCap的IVT反應(yīng)液中合成的FLuc mRNA沒(méi)有觀察到活性。這表明Cap結(jié)構(gòu)對(duì)于mRNA有效翻譯成蛋白質(zhì)是必不可少的。 |
| 模板DNA加量與RNA產(chǎn)量的關(guān)系(20 μl反應(yīng)體系) |
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| 使用不同量的Positive Control Template (FLuc) 作為模板（20 μl 反應(yīng)體系），加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷進(jìn)行IVT反應(yīng)。結(jié)果顯示，RNA 產(chǎn)量在模板DNA 0.5 μg 時(shí)達(dá)到峰值，而高于該模板加量（0.5～2 μg）時(shí)，RNA產(chǎn)量變化很小。 |
| IVT反應(yīng)液體積與RNA產(chǎn)量的關(guān)系 |
 A．IVT反應(yīng)液體積與RNA產(chǎn)量的關(guān)系
 線性關(guān)系
 每20μl反應(yīng)溶液的RNA產(chǎn)量 (μg)
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| B. 使用Bioanalyzer分析RNA產(chǎn)物 |
| A) 以Positive Control Template（FLuc）為模板，加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 進(jìn)行IVT放大實(shí)驗(yàn)。除反應(yīng)液體積外均按說(shuō)明書所述進(jìn)行。 由此可見(jiàn)，RNA 產(chǎn)量與反應(yīng)體積成正比，并且按比例放大反應(yīng)溶液體積不會(huì)影響產(chǎn)量。 B) 對(duì)A中獲得的 1 ng RNA產(chǎn)物通過(guò)Bioanalyzer分析表明：IVT反應(yīng)體積的放大不會(huì)影響RNA產(chǎn)物的質(zhì)量。 |
| IVT反應(yīng)液體積與RNA產(chǎn)量的關(guān)系 |
 A．IVT反應(yīng)時(shí)間與RNA產(chǎn)量的關(guān)系分析
 B．使用Bioanalyzer分析RNA產(chǎn)物
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| A) 使用Positive Control Template (FLuc)作為模板，加入CleanCap Reagent AG (3'OMe) 和N1-甲基假尿苷進(jìn)行不同反應(yīng)時(shí)間的IVT 反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)合成的mRNA的長(zhǎng)度為大約1.9 kb時(shí)，RNA產(chǎn)量在約1小時(shí)內(nèi)幾乎趨于平穩(wěn)，并且在此之后(1～16小時(shí))觀察到的變化很小。 B) 對(duì)A中獲得的1 ng RNA產(chǎn)物通過(guò)Bioanalyzer分析表明：反應(yīng)時(shí)間不會(huì)影響RNA產(chǎn)物的質(zhì)量。 |
| IVT合成RNA后純化回收效果的比較（產(chǎn)量和質(zhì)量的比較） |
 A．通過(guò) LiCl 沉淀法與離心柱法進(jìn)行RNA純化的比較
 B．不同方法純化的FLuc mRNA在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況
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| A) 在含有CleanCap Reagent AG（3'OMe）和N1-甲基假尿苷的IVT反應(yīng)液中合成FLuc mRNA，并分別通過(guò)LiCl沉淀法和離心柱法（NucleoSpin RNA Clean-up（Code No. 740948.10等））進(jìn)行純化。 結(jié)果顯示，用離心柱法僅一次洗脫(Elution x1)得到的RNA比LiCl沉淀法少，但兩次洗脫(Elution x2)的RNA量與LiCl沉淀法大致相同。所以我們強(qiáng)烈建議在使用離心柱法時(shí)進(jìn)行兩次洗脫。 B) 使用TransIT-mRNA Transfection Kit將A中獲得的0.5 μg RNA轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。24小時(shí)后，收集細(xì)胞，測(cè)定FLuc的活性，確認(rèn)兩者的活性與市面上銷售的FLuc mRNA positive control相同甚至更高。 |
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