| Poly（A）序列后面剩余的堿基數(shù)與翻譯效率的關(guān)系 |
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| 圖1.BspQ I的識(shí)別序列、切割位點(diǎn)和反轉(zhuǎn)圖像 Type IIS限制酶的BspQ I的識(shí)別序列 (紅框) 和切割位點(diǎn) (藍(lán)箭頭) 。切割位點(diǎn)位于識(shí)別序列之外。 |
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| 圖2.含有Poly（A）的IVT模板DNA質(zhì)粒的限制酶識(shí)別序列設(shè)計(jì)、線性化后的末端結(jié)構(gòu)及IVT RNA序列 為了探討Poly (A) 序列以后殘留堿基的影響，使用限制酶處理質(zhì)粒，使Poly（A）序列后殘留的堿基數(shù)量不同，形成對(duì)照。用含有CleanCap Reagent AG (3OMe) 和N1-Methylpseudo-UTP的IVT反應(yīng)合成了FLuc mRNA。IVT RNA的Poly (A) 之后的殘留堿基序列以紅色字母表示。 ※Hind III (3 nt剩余) 的設(shè)計(jì)與Linearized Template Vector (Code No. 6143的產(chǎn)品組分) 相同。 |
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| 圖3 HEK 293 T細(xì)胞Poly (A) 序列剩余堿基數(shù)量對(duì)mRNA翻譯效率的影響 使用TransIT-mRNA Transfection Reagent，將獲得的0.5 μg RNA轉(zhuǎn)染到HEK 293 T細(xì)胞中。24小時(shí)后回收細(xì)胞，測(cè)定FLuc的活性。結(jié)果顯示，由殘留23 nt的質(zhì)粒模板制備的mRNA，與其他相比，活性明顯降低。 另一方面，殘留堿基為5 nt以下的情況下均顯示出高活性，雖然差別不大，但隨著殘留堿基的減少，活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。由于在剩余堿數(shù)為0 nt時(shí)翻譯效率最大，因此在設(shè)計(jì)以mRNA合成為目的的模板DNA質(zhì)粒時(shí)，推薦使用BspQ I等Type IIS限制酶。 ※Poly（A）在序列下游的殘留堿基為3 nt的Hind III線性化時(shí)，雖然翻譯效率略有下降，但與剩余堿基0 nt的結(jié)果差別不大。 |
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