| 實(shí)驗(yàn)例1-不同情況下mRNA合成產(chǎn)量的比較 |
| 實(shí)驗(yàn)方法：以螢火蟲熒光素酶 （FLuc） mRNA 編碼的 DNA（Takara IVTpro T7 mRNA合成試劑盒（Code No. 6144）的組分中的陽性對照（FLuc））為模板，分別比較體外轉(zhuǎn)錄模板（IVT）在添加或不添加Pyrophosphatase (inorganic), HQ（IPP）情況下mRNA合成的產(chǎn)量。在IVT反應(yīng)中，使用T7 RNA Polymerase, HQ（Code No. 2542A）來合成mRNA，使用Cap類似物CleanCap Reagent AG（3'OMe）（TriLink公司）來合成Cap結(jié)構(gòu)的mRNA。制備過程中向IVT反應(yīng)體系中加入IPP，濃度為0.005U/μl或0.01U/μl。 說明：核酸合成過程中產(chǎn)生的無機(jī)焦磷酸鹽（PPi）與體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應(yīng)中聚合酶的輔助因子Mg2+反應(yīng)生成沉淀，抑制合成反應(yīng)的進(jìn)行。 Pyrophosphatase (inorganic)（IPP）可以將PPi分解成正磷酸鹽（H3PO4），從而阻止沉淀的生成，并促進(jìn)合成反應(yīng)的正向進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：無論mRNA是否含有Cap結(jié)構(gòu)，mRNA的產(chǎn)量在添加IPP后均為未添加IPP的2倍。 |
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