| 實驗例-Poly(A)序列后冗余堿基對IVT合成mRNA在細胞內(nèi)蛋白表達的影響 |
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| A. 模板質(zhì)粒的線性化設(shè)計對IVT合成mRNA的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的影響 |
| 【方法】
Firefly Luciferase (FLuc) mRNA編碼的三種模板質(zhì)粒[pFLuc-142A (BspQ I)， pFLuc-102A (BspQ I)和pFLuc-105A (Hind III)]*1分別使用Poly(A)序列后的不同限制性酶位點進行切割，使用CleanCap進行體外轉(zhuǎn)錄 (IVT)合成mRNA*2。最后將每個0.5 μg的mRNA轉(zhuǎn)入HEK293T細胞中， 培養(yǎng)24小時后對Fluc活性進行測定。 *1三種質(zhì)粒序列除了Poly(A)序列長度和Poly(A)序列后的限制酶位點以外都是相同的。 *2樣本名表示mRNA的Poly(A)序列長度、用于線性化的限制酶以及Poly(A)序列后的冗余堿基數(shù)(括號內(nèi))。 【結(jié)果】 在任何一種質(zhì)粒中，隨著Poly(A)序列后的冗余堿基數(shù)量的增加，F(xiàn)Luc蛋白質(zhì)的表達量大幅降低。由此表明，模板質(zhì)粒的線性化設(shè)計對目的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的表達有很大影響。 |
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| B. mRNA的Poly (A) 序列長度的增加會提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達量 |
| 【方法】 關(guān)于Poly(A)序列長度的增加(約40個堿基)和Poly(A)序列后3個冗余堿基的影響，F(xiàn)Luc的蛋白質(zhì)表達是否有明顯差異，以n=4進行了與A相同的實驗。 【結(jié)果】 FLuc mRNA的Poly(A)序列長度增加40個堿基時，蛋白質(zhì)表達明顯提高[141A - BspQ I (0) vs. 101A - BspQ I (0); 28.5% (p=0.026)，141A-BspQ I (0) vs. 105A - Hind III (3); 28.9% (p=0.017)]。因此，使用Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis構(gòu)建的質(zhì)粒模板可以替換Linearized Template Vector(Code No. 6143)并能夠制備出更高表達的目的mRNA。 另一方面，Poly(A)序列長度相近的101A - BspQ I(0)和105A - Hind III (3)， FLuc蛋白質(zhì)的表達差異非常小(p=0.959)。因此，可以確認，3個冗余堿基對蛋白質(zhì)的表達影響非常小。 |
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