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利用CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)新冠病毒宿主因素
 
發(fā)現(xiàn)宿主因素對(duì)于了解新冠病毒發(fā)病機(jī)理以及識(shí)別新的治療靶標(biāo)是至關(guān)重要的。在病毒學(xué)研究領(lǐng)域，CRISPR篩選非常適用于病毒-宿主相互作用分析；確定對(duì)病毒入侵，復(fù)制和傳播至關(guān)重要的宿主因素；確定新藥物靶點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)先次序排序。利用sgRNA文庫(kù)進(jìn)行基因組規(guī)模的CRISPR/Cas9基因敲除篩選，可以幫助我們識(shí)別引起疾病反應(yīng)的重要宿主因素。
 
■ 一步操作方案，輕松制備高質(zhì)量sgRNA文庫(kù)。
Takara可以提供混合的慢病毒sgRNA文庫(kù)系統(tǒng)Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System，用于在人細(xì)胞中進(jìn)行表型敲除篩選。該文庫(kù)系統(tǒng)基于Brunello文庫(kù)（Doench et al. 2016; Doench et al. 2018）設(shè)計(jì)，包含超過(guò)76,000條向?qū)NA（sgRNA），靶向約19,000個(gè)基因，每個(gè)基因有四條高效的向?qū)NA以及非靶向sgRNA對(duì)照。這個(gè)擴(kuò)增文庫(kù)經(jīng)過(guò)了充分驗(yàn)證，以可即時(shí)轉(zhuǎn)染的凍干形式提供，可以讓您輕松制備出高滴度慢病毒并建立全基因組CRISPR篩選。
 
正如下圖所示，我們的sgRNA文庫(kù)系統(tǒng)，以單管凍干混合物形式提供，其中包含sgRNA載體，Lenti-X包裝質(zhì)粒和Xfect轉(zhuǎn)染試劑。該系統(tǒng)通過(guò)高效的一步操作方案，可輕松完成轉(zhuǎn)染和慢病毒制備過(guò)程。
 
 
CRISPR篩選后，可進(jìn)行NGS分析，鑒定感興趣的候選基因。Takara提供的NGS分析試劑盒Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit包含以全基因組sgRNA文庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞集群為起始樣品，制備Illumina測(cè)序用NGS文庫(kù)所需要的引物和試劑。
 
■ 嚴(yán)緊的質(zhì)量控制，以確保sgRNA代表性。
為了確保正確的sgRNA代表性，Takara對(duì)sgRNA文庫(kù)進(jìn)行了精心制作，測(cè)定了每一步操作的sgRNA代表性：包括文庫(kù)合成、擴(kuò)增、病毒制備和靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。下圖Panel A展示了質(zhì)粒文庫(kù)中向?qū)NA的代表性。將基于Brunello的sgRNA庫(kù)克隆到pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg載體中并進(jìn)行擴(kuò)增。使用NGS技術(shù)分析驗(yàn)證質(zhì)粒DNA文庫(kù)sgRNA的代表性。檢測(cè)結(jié)果顯示，文庫(kù)中超過(guò)90%的sgRNAs在10倍分布范圍以內(nèi)。圖表中的柱形表示具有特定讀段數(shù)的sgRNA數(shù)量。下圖Panel B為質(zhì)粒文庫(kù)和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中sgRNA代表性的比較。以潮霉素為篩選標(biāo)記，篩選出Cas9+/sgRNA+ A375細(xì)胞，提取基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序分析PCR產(chǎn)物，檢測(cè)PCR產(chǎn)物中每一個(gè)整合的sgRNA相對(duì)于起始質(zhì)粒DNA文庫(kù)的讀段數(shù)。Spearman和Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，這兩者都具有很強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明這個(gè)系統(tǒng)無(wú)論是在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中還是篩選后的細(xì)胞中都可以有效保持sgRNA的代表性。
 
 
Code No. 產(chǎn)品名稱 包裝量
632646 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System 5 Screens
632647 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit 10 Rxns
632651 Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit 20 Rxns
 
使用全基因組CRISPR篩選進(jìn)行病毒學(xué)研究發(fā)表的部分文獻(xiàn)
1. Flint, M. A genome-wide CRISPR screen identifies N-acetylglucosamine-1-phosphate transferase as a potential antiviral target for Ebola virus. Nat. Comm. 285, (2019).
2. Gebre, M. et al. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses 10, 55 (2018).
3. Han, J. Genome-wide CRISPR/Cas9 Screen Identifies Host Factors Essential for Influenza Virus Replication. Cell Rep. 23, 596-607 (2018).
4. Li, B. et al. Genome-wide CRISPR screen identifies host dependency factors for influenza A virus infection. Nat. Comm. 11, 164 (2020).
5. Marceau, C. D. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature 535, 159-163 (2016).
6. Park, R. J. A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors. Nat. Genet. 49, 193-203 (2017).
8. Puschnik, A. S. et al. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nat. Rev. Microbiol. 15, 351-364 (2017).
 
參考文獻(xiàn)：
1. Doench, J. G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184-191 (2016).
2. Doench, J. G. et al. Am I ready for CRISPR A user's guide to genetic screens. Nat. Rev. Genet. 19, 67-80 (2018).
 
 
 

頁(yè)面更新：2020-05-15 10:13:29