| 50篇20分↑文章，網(wǎng)友：免疫組庫分析要火？！ |
| 因新冠引起關(guān)注的不止病原mNGS分析 |
| 近幾個(gè)月常有這樣的新聞： |
| 重慶醫(yī)科大學(xué)金艾順教授團(tuán)隊(duì)開展新冠肺炎患者恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞中特異性T淋巴細(xì)胞抗原肽及T細(xì)胞受體（TCR）的篩選1… 軍事科學(xué)院陳薇院士聯(lián)合中科院生物物理所王曉群研究員以及北京師范大學(xué)吳倩團(tuán)隊(duì)，通過綜合單細(xì)胞RNA測(cè)序和V(D)J重組分析，揭示了新冠肺炎患者體內(nèi)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜和變化2… |
| 可以發(fā)現(xiàn)，這些報(bào)道主要著墨新冠與免疫，探討機(jī)體免疫細(xì)胞表面受體或免疫組庫變化規(guī)律，揭示病毒入侵人體后的免疫機(jī)制，為抗體藥物或疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。 從某種意義上講，新冠將“免疫組庫“的概念帶進(jìn)大眾視野，讓人們對(duì)其產(chǎn)生興趣，同時(shí)也存有不少疑惑。 所以，接下來我們一起了解一下免疫組庫。 開篇之前，先來看一組不完全統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)： |
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| 數(shù)據(jù)來源：PubMed網(wǎng)站“Immune Repertoire”關(guān)鍵詞統(tǒng)計(jì) |
| 數(shù)據(jù)顯示，免疫組庫相關(guān)的文章發(fā)表數(shù)近幾年呈現(xiàn)上漲趨勢(shì)。特別是20分以上的文章數(shù)，2019年是2018年的1.5倍，增至50篇，增幅明顯。 文章數(shù)量的增多表明國內(nèi)外越來越多的科研人員投身免疫組庫的研究陣營。加之疫情的“助推”，免疫組庫曝光增多，后期成為科研界的黑馬并非不可能。 好了，讓我們帶著問題深度了解免疫組庫。 |
| 何為免疫組庫？ |
| 免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。（免疫系統(tǒng)的多樣性對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要，多樣性越高，免疫系統(tǒng)就越強(qiáng)大） |
| 我們都知道，機(jī)體的獲得性免疫能識(shí)別無數(shù)種抗原分子，并隨之做出反應(yīng)。其分子基礎(chǔ)為T細(xì)胞表面受體和B細(xì)胞表面受體（TCR和BCR）特異性識(shí)別抗原區(qū)段，激活免疫應(yīng)答。這意味著TCR和BCR需呈現(xiàn)高多樣性，具有識(shí)別各種各樣抗原的可能。多樣性體現(xiàn)為受體基因V(D)J片段重組，因此分析多樣性主要是分析V(D)J片段的序列特征。 |
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| 免疫組庫分析有何應(yīng)用？ |
| 通常意義上，免疫組庫分析應(yīng)用廣泛。 一些基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，如自身性免疫、腫瘤等疾病的機(jī)制探討，或者免疫療法的研發(fā)，都需要正確分析TCR、BCR的多樣性或亞基配對(duì)信息！ |
| 舉個(gè)具體例子↓ 來自UNC腎臟中心的Dr. Meghan E. Free3團(tuán)隊(duì)致力研究抗中性粒細(xì)胞胞漿自身抗體血管炎（ANCA血管炎，一種自身免疫疾病）的機(jī)制。通過結(jié)合HLA、TCR測(cè)序等多種技術(shù)，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)自身反應(yīng)CD4+ T細(xì)胞表面受體多樣性遠(yuǎn)低于初始T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞，并最終確認(rèn)了限制性髓過氧化物酶與ANCA血管炎患者免疫反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)。 其中，該團(tuán)隊(duì)所使用的TCR測(cè)序即采用NGS分析TCR多樣性的技術(shù)，后文會(huì)詳細(xì)闡述。 |
| 如何正確分析免疫組庫？ |
| 傳統(tǒng)方法包括克隆和桑格測(cè)序，或者抗原特異性功能驗(yàn)證（e.g.四聚體試驗(yàn)/染色）。不過這些方法通量較低，無法對(duì)免疫組庫多樣性提供完整、正確分析。 大概在2009年，科研人員開始采用NGS技術(shù)分析免疫庫，大大地提升了分析規(guī)模與通量。 由此，NGS成了免疫組庫主流的分析方法。不過，要想得到預(yù)期的免疫組庫分析結(jié)果，還得掌握正確的“打開方式”↓ |
| 選擇DNA還是RNA起始？ |
| 每個(gè)細(xì)胞僅一條DNA模板，理論上以DNA起始更容易確定克隆型的相對(duì)豐度。但是，每個(gè)細(xì)胞可能有多拷貝的TCR或者BCR轉(zhuǎn)錄本，因此以RNA為模板會(huì)更靈敏，對(duì)特定的受體變體分析更完整，包括稀有表達(dá)的受體。 此外，mRNA測(cè)序分析的是已表達(dá)并經(jīng)剪切、轉(zhuǎn)錄后加工的受體序列，更容易獲得功能蛋白信息。相反，基于DNA的方法會(huì)得到大量與功能無關(guān)的序列信息。 |
| 選擇全長序列分析還是只分析CDR3區(qū)？ |
| 一些科研人員只關(guān)注TCR或者BCR序列的CDR3區(qū)域（互補(bǔ)決定區(qū)3），這是由于CDR3區(qū)包含抗原-受體作用的核心位點(diǎn)，也是變化最多的區(qū)域。 |
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| 然而，全長測(cè)序能提供受體序列額外的區(qū)域信息，包括CDR1和CDR2。這些區(qū)域參與抗原-受體結(jié)合的親和性、下游信號(hào)傳遞。另外，獲得的全長序列還可應(yīng)用于克隆實(shí)驗(yàn)，對(duì)抗體及T細(xì)胞治療的研發(fā)尤為重要。 |
| *重中之重是要選擇合適的NGS建庫策略 |
| 常見的兩種免疫組庫NGS文庫制備技術(shù)包括多重PCR與5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）。 |
| 多重PCR支持DNA和RNA起始，通常包括兩輪PCR。第一輪PCR可擴(kuò)增出受體基因座，并添加用于二輪PCR引物位點(diǎn)的已知序列，測(cè)序接頭與index隨后整合。然而，第一輪PCR overlap sites的引物位點(diǎn)存在高多樣性，需大量簡并引物，因此易引入PCR bias。 另一種技術(shù)整合了SMART（Switching Mechanism at 5’end of RNA Template）與5’RACE。這種技術(shù)只適用RNA作為模板，每輪PCR僅需一對(duì)引物，能顯著降低PCR偏差，確保結(jié)果反映樣本的真實(shí)情況。并且具有更高的on-target率，能降低測(cè)序成本。 |
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| Takara推出的SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2和SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit，分別能提供人TCR、BCR克隆型更正確的分析結(jié)果↓ |
| SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 （TCRv2） |
| · 支持total RNA (10 ng-1 μg外周血淋巴細(xì)胞來源或 1 ng-100 ng T細(xì)胞來源 total RNA)或純化后完整的T細(xì)胞（1,000-10,000個(gè)）起始； · 添加UMI與UDI建庫，用以校正錯(cuò)誤reads、減少index hopping，結(jié)果更可靠； · 可自由選擇Miseq平臺(tái)（分析V(D)J 全長），或是其它Illumina平臺(tái)（分析CDR3）； · 流程完整，Cogent NGS Immune Profiler Software完成測(cè)序數(shù)據(jù)分析； |
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| 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，添加UMI能將摻入的Jurkat RNA TRBV12-3克隆型的檢測(cè)極限下探至0.001%！ |
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| 與同類型產(chǎn)品比較，TCRv2文庫所獲得的克隆型數(shù)量遠(yuǎn)高于Company X RNA法及Company Y DNA法的結(jié)果。（數(shù)據(jù)來源于Takara Bio USA, Inc.） |
| 由于性能出色，很多客戶選擇Takara Human TCR系列產(chǎn)品，如前文提到的Dr. Meghan案例，正是用的前代產(chǎn)品TCRv1構(gòu)建文庫！ |
| SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit |
| · 支持PBMC（10 ng-1 μg）或B細(xì)胞（1 ng-100 ng）來源的total RNA起始； · 添加UMI建庫，提供更正確的V(D)J全長信息分析； · 流程完整，Cogent NGS Immune Profiler Software完成測(cè)序數(shù)據(jù)分析； |
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| 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不同RNA起始量， BCR profiling文庫均可靈敏且正確地得到不同亞基的克隆型數(shù)據(jù)。 |
| 下期預(yù)告 |
| 隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多科研人員開始關(guān)注單細(xì)胞免疫組庫分析。 那么以單細(xì)胞起始，關(guān)注點(diǎn)與群體細(xì)胞有何不同？ 應(yīng)該采取什么對(duì)應(yīng)的科研策略？ 敬請(qǐng)期待…… |
| 參考信息來源及文獻(xiàn)： |
| 1. 重醫(yī)團(tuán)隊(duì)在新冠病毒T細(xì)胞免疫研究取得突破性進(jìn)展，重慶醫(yī)科大學(xué)官網(wǎng)，2020-05-18 2. 研究揭示新冠患者體內(nèi)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜變化，科學(xué)網(wǎng)，2020-05-30 3. Free M E , Stember K G , Hess J J , et al. Restricted myeloperoxidase epitopes drive the adaptive immune response in MPO-ANCA vasculitis[J]. Journal of Autoimmunity, 2019:102306. |
| 苦于實(shí)驗(yàn)反復(fù)優(yōu)化，文章沒有突破？ 點(diǎn)擊文末鏈接，直通高分免疫組庫研究策略?。ㄚs緊備一套） |
| 高分免疫組庫研究策略 |
| Human TCR profiling策略 |
| Human BCR profiling策略 |
頁面更新：2020-08-06 08:40:30
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