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單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組 × 靶向富集—低表達(dá)基因融合事件快現(xiàn)形！

在生物體中，對(duì)各類(lèi)低表達(dá)事件開(kāi)展分析鑒定研究，一直以來(lái)為科研人員津津樂(lè)道。但是要想對(duì)它們進(jìn)行準(zhǔn)確地檢測(cè)鑒定，卻并非想象中那樣容易。

在熱度頗高的腫瘤研究領(lǐng)域，關(guān)于稀有融合基因、轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的研究一直備受關(guān)注。有研究表明，這些低頻事件是與癌癥發(fā)生相關(guān)聯(lián)的（Yu et al. 2019，Mertens et al. 2015）。

ICELL8 cx Single-Cell System是基于微孔芯片技術(shù)的高通量單細(xì)胞分選系統(tǒng)，用于高通量的單細(xì)胞NGS研究。ICELL8 cx系統(tǒng)及其配備的單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用為廣大科研工作者帶來(lái)了應(yīng)對(duì)低表達(dá)生物學(xué)研究的好方法。現(xiàn)在就和大家一同來(lái)看一看，單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和靶向富集配合時(shí)是一種怎樣的研究體驗(yàn)。

介紹案例之前，先對(duì)ICELL8 cx單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用做一個(gè)簡(jiǎn)單的講解：

下面的示意圖展示了單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)流程。

首先，將細(xì)胞樣品分注到微孔芯片中完成單細(xì)胞的分選工作。然后，為選中的單細(xì)胞加入RT-PCR試劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的cDNA合成。得到cDNA后，繼續(xù)添加P5 index接頭序列。接著，我們要對(duì)全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行酶切片段化。完成片段化操作后，繼續(xù)加入P7 index接頭序列，進(jìn)行一次PCR反應(yīng)，將P5 index / P7 index接頭連接到文庫(kù)片段兩側(cè)，并擴(kuò)增。最后，將連接好接頭序列的文庫(kù)產(chǎn)物從芯片中回收，并進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，以達(dá)到測(cè)序儀的上機(jī)要求。

介紹太抽象，不夠具體？

沒(méi)關(guān)系！看看ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)的操作軟件界面展示的單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用流程：

示意圖中展示了芯片內(nèi)五個(gè)反應(yīng)步驟，在軟件界面上一一對(duì)應(yīng)了按鍵。細(xì)心的您可能發(fā)現(xiàn)，其中多了一個(gè)“Scan chip”按鍵。它用于對(duì)分注了細(xì)胞樣品的芯片進(jìn)行掃描拍照。獲取的圖像信息會(huì)經(jīng)過(guò)ICELL8 cx搭載的CellSelect軟件分析處理，提供一份微孔芯片中“活的單細(xì)胞”位置信息。后續(xù)各種建庫(kù)試劑的添加僅在這些位置執(zhí)行。

單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組小課堂結(jié)束，我們開(kāi)始本次的案例介紹！

本次案例中，靶向富集的目標(biāo)選擇了BCR基因和ABL1基因。位于22號(hào)染色體上的BCR基因和位于9號(hào)染色體上ABL1基因，由于染色體易位的發(fā)生，會(huì)產(chǎn)生BCR-ABL1融合。通常會(huì)導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病，也就是我們常說(shuō)的“慢粒”。
除了BCR基因和ABL1基因外，同時(shí)也對(duì)PAX5，ETV6和EP300，ZNF384進(jìn)行了富集檢測(cè)分析。

通過(guò)ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)，分選得到了1,512個(gè)K562細(xì)胞，選取鑒定到費(fèi)城染色體（the Philadelphia chromosome）的K562細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。
首先完成單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。然后，在該文庫(kù)的基礎(chǔ)上對(duì)本次選定的目標(biāo)基因進(jìn)行富集。本案例中設(shè)計(jì)的富集探針為5’生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針。
對(duì)于未經(jīng)富集和經(jīng)過(guò)富集的數(shù)據(jù)統(tǒng)一使用我們的分析軟件Cogent NGS Analysis Pipeline進(jìn)行reads的比對(duì)。

華麗的分割線

◆ 對(duì)單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行BCR和ABL1富集后，提高了對(duì)含BCR-ABL1融合基因細(xì)胞的鑒定能力。

對(duì)單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行BCR和ABL1富集后，提高了對(duì)含BCR-ABL1融合基因細(xì)胞的鑒定能力。

對(duì)于未經(jīng)富集的檢測(cè)組（綠色）來(lái)說(shuō)，即使在reads 深度超過(guò)1.6 M的情況下，1,512個(gè)細(xì)胞中僅40個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到含有BCR-ABL1融合轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。
相比之下，經(jīng)過(guò)靶向富集的檢測(cè)組（藍(lán)色），在reads深度582 K的情況下，檢測(cè)到264的細(xì)胞含有BCR-ABL1融合轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。

◆ 當(dāng)我們進(jìn)一步對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行分析后可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于BCR-ABL1融合基因來(lái)源的junction reads和spanning reads，檢測(cè)效果均得到顯著提升。

	未富集文庫(kù)	未富集文庫(kù)
BCR-ABL1 junction reads	13	1,735
BCR-ABL1 spanning reads	39	6,420
鑒定到任意一種融合的細(xì)胞數(shù)	590	280
鑒定到BCR-ABL1融合基因的細(xì)胞數(shù)	40	264

參考DepMap數(shù)據(jù)庫(kù)信息，ICELL8 cx單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用成功鑒定到了K562細(xì)胞中預(yù)期可以被檢測(cè)到的幾種融合基因。

對(duì)于未經(jīng)富集的文庫(kù)，表達(dá)BCR-ABL1融合轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞數(shù)僅占含融合基因細(xì)胞總數(shù)的~7%（40/590）；經(jīng)富集處理后，表達(dá)BCR-ABL1融合轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞占比達(dá)到了~94%（264/280）。

在需要對(duì)稀有事件和特定區(qū)域進(jìn)行深入的研究時(shí)，靶向富集方法是一個(gè)強(qiáng)有力的工具，可以很好地提升檢測(cè)能力。通過(guò)上面的案例數(shù)據(jù)，展示了ICELL8 cx單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用與靶向富集聯(lián)用后的強(qiáng)大效果。

關(guān)于該案例的更多信息現(xiàn)已進(jìn)行了匯總，掃描下方二維碼快來(lái)申領(lǐng)吧！

【參考文獻(xiàn)】
Mertens, F. et al., The emerging complexity of gene fusion in cancer. Nature Reviews Cancer (2015)
Yu, Y. et al., Identification of recurrent fusion genes across multiple cancer types. Sci. Rep. 9, 1074 (2019)

更多單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用介紹點(diǎn)擊查看

頁(yè)面更新：2020-11-10 11:29:53

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