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無(wú)標(biāo)題文檔

無(wú)需RNA純化，生物樣本直接qPCR—新冠病毒檢測(cè)

2019年，Takara發(fā)布了無(wú)需RNA提取，可直接使用生物樣本進(jìn)行定量PCR的新產(chǎn)品PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)（Code No.RR650/651）。該技術(shù)不僅引起了分子生物試劑行業(yè)的關(guān)注，更為大量IVD客戶、醫(yī)藥研究人員等帶來(lái)了簡(jiǎn)便、快速的體驗(yàn)。尤其在新冠肺炎疫情下，無(wú)需RNA提取即可進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)，可以大大緩解人力、時(shí)間等壓力。

Takara和各國(guó)研究人員已經(jīng)使用PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix對(duì)各種樣本進(jìn)行了直接qPCR的實(shí)驗(yàn)，成功的檢測(cè)結(jié)果讓您可以有充足的信心告別繁瑣的RNA提取，進(jìn)入快速、直接qPCR新時(shí)代。

實(shí)驗(yàn)例新冠病毒的直接qPCR檢測(cè)

Lübke等科學(xué)家在《Journal of Clinical Virology》發(fā)表了題為《Extraction-free SARS-CoV-2 detection by rapid RT-qPCR universal for all primary respiratory materials》的文獻(xiàn)，文章中作者以PrimeDirect^™ Probe RT-qPCR Mix（Code No.RR650）為基礎(chǔ)，研發(fā)了無(wú)需RNA提取、直接進(jìn)行新冠病毒qPCR檢測(cè)的方法。

下面簡(jiǎn)要介紹文章中的反應(yīng)體系和操作流程，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可能需要用戶進(jìn)行優(yōu)化。

樣本收集

為了保持反應(yīng)靈敏度，樣品在4℃下冷凍或儲(chǔ)存時(shí)間不得超過(guò)7天。本方案適用于所有主要呼吸樣本。

1. 使用Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)對(duì)粘性樣本進(jìn)行預(yù)處理。
2. 將50 μl樣本在99℃下加熱滅活5分鐘。
3. 加熱的樣本4000 rpm離心5分鐘。
4. 向以下反應(yīng)混合物中添加5 μl上清液。

反應(yīng)體系

可以先配制不含樣本的反應(yīng)試劑master mix，分裝為20 μl/rxn，冷凍保存，在一周內(nèi)使用。

組分	液量（μl）
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X)	12.5 μl
Forward Primer	終濃度400 nM
Reverse Primer	終濃度400 nM
qPCR probe	終濃度200 nM
Viral PBS sample	5 μl
RNase Free H2O	Fill to 25 μl
Total	25 μl

新冠病毒檢測(cè)用引物和探針，使用乙型肝炎S抗原基因作為內(nèi)對(duì)照

Name	目的基因	序列	反應(yīng)液終濃度
CoV-E-F	E gene	CTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCT	400 nM
CoV-E-R	E gene	TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA	400 nM
CoV-E-Pr	E gene	FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ	200 nM
HBV-Taq1	HBV-SynQ*	CAACCTCCAATCACTCACCAAC	200 nM
HBV-Taq2	HBV-SynQ*	ATATGATAAAACGCGCAGACAC	200 nM
HBV-IC	HBV-SynQ*	Cy5-CTGCCGAGCTCTGACTA-BHQ	200 nM

*HBV-SynQ (internal control): 合成的質(zhì)粒，編碼失活的乙型肝炎S抗原。

反應(yīng)條件

90℃	30 sec	變性（粗提·核酸純化）
60℃	5 min	反轉(zhuǎn)錄
PCR循環(huán)圈數(shù): 45
95℃	5 sec	變性
60℃	30 sec	退火/延伸

結(jié)論

作者使用上述方法，對(duì)于常規(guī)方法Ct值＜35的樣本的直接qPCR檢出率為95.8%，對(duì)于全部樣本（Ct值較高、保存時(shí)間較長(zhǎng)）的直接qPCR檢出率為81.3%。
該方法具有靈活、快速的特點(diǎn)，可在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)于新冠病毒核酸的qPCR檢測(cè)。

作者簡(jiǎn)介

Dr. Nadine Lübke是醫(yī)學(xué)專家病毒學(xué)家，也是德國(guó)杜塞爾多夫大學(xué)病毒研究所的基因分型和抗性測(cè)試負(fù)責(zé)人。她專注于研究對(duì)HIV的抗病毒治療的抗性，最近獲得了德國(guó)抗病毒病協(xié)會(huì)（DVV）和病毒學(xué)會(huì)（GfV）頒發(fā)的2019年臨床病毒學(xué)科學(xué)獎(jiǎng)。除了在艾滋病毒抗性測(cè)試領(lǐng)域的多年臨床和科學(xué)工作外，Dr. Nadine Lübke還運(yùn)用她的專業(yè)知識(shí)來(lái)幫助抗擊COVID-19大流行。

您可以點(diǎn)擊webinar鏈接，由Dr. Nadine Lübke為您詳細(xì)介紹她的團(tuán)隊(duì)如何開(kāi)發(fā)出這種簡(jiǎn)便快速的RT-qPCR檢測(cè)方法來(lái)直接檢測(cè)SARS-CoV-2，而不需要提取RNA。

杜塞爾多夫醫(yī)院目前正在使用這種檢測(cè)方法，在與感染患者接觸的醫(yī)生和工作人員中頻繁地篩查COVID-19，這對(duì)于防止感染的局部傳播至關(guān)重要。

頁(yè)面更新：2021-10-19 14:16:51

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