| 面對(duì)日益增長的癌癥發(fā)病率，融合基因分析緣何受到關(guān)注？ |
| 不想承認(rèn)但不得不承認(rèn)的事實(shí)是：癌癥依然是全球主要的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅人類生命健康。 |
| 而中國的情況更不容樂觀。由于人口老齡化、工業(yè)化、生活方式改變等因素，我國每年癌癥的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別占全球的23.7%和30%，并持續(xù)增加，癌癥防控形勢十分嚴(yán)峻[1]。 |
| 好在精準(zhǔn)醫(yī)療概念的出現(xiàn)，為人類攻克癌癥帶來了希望。其中分子診斷成為發(fā)展最快的體外診斷細(xì)分領(lǐng)域，已進(jìn)入多樣化應(yīng)用場景，如腫瘤伴隨診斷、腫瘤早期篩查等等。 |
| 伴隨診斷是靶向用藥，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的關(guān)鍵，而NGS技術(shù)由于可在單一檢測中同時(shí)分析與患者癌癥相關(guān)的所有基因組改變及標(biāo)志物，具有較高準(zhǔn)確性，是未來的發(fā)展方向，市場前景廣闊。 |
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| 不過在我國，目前NGS伴隨診斷的滲透率仍相對(duì)較低，僅有6.4%的晚期癌癥患者和被建議基因分型的癌癥患者采用了NGS伴隨診斷檢測（美國約23.5%）。從市場規(guī)模看，有機(jī)構(gòu)預(yù)計(jì)2030年中國NGS癌癥伴隨診斷市場規(guī)模將達(dá)到約45億美元，而2019年這一數(shù)據(jù)估計(jì)為3億美元[2]，存在巨大的增長空間。 |
| 因此，眾多廠商紛紛投身這一藍(lán)海市場，推出具有自身特色的NGS伴隨診斷服務(wù)。 |
| 通過公開途徑調(diào)查，小編發(fā)現(xiàn)僅寥寥幾家廠商推出了基于RNA水平的NGS檢測，絕大多數(shù)廠商的服務(wù)都基于DNA水平。因此，目前DNA-Seq是業(yè)內(nèi)采用的主流技術(shù)。 |
| 不過，在與一些頭部廠商交流時(shí)，小編留意到部分廠商開始計(jì)劃或正在研發(fā)、優(yōu)化RNA水平的伴隨診斷NGS項(xiàng)目，并且項(xiàng)目有一個(gè)共同點(diǎn)——融合基因檢測！ |
| 那么融合基因檢測緣何受到關(guān)注？相較于DNA水平，RNA水平的融合基因檢測又有何優(yōu)勢？ |
| 跟著小編一起來解密。 |
| 融合基因是指兩個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連構(gòu)成的嵌合基因，即由兩個(gè)基因的部分序列拼接在一起形成的，其表達(dá)產(chǎn)物為融合轉(zhuǎn)錄本。主要是由染色體易位、缺失或倒位所致。 |
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| 可以看出，融合基因是由染色體變異所致，而且發(fā)生融合的基因往往是癌癥驅(qū)動(dòng)基因[3]。當(dāng)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的基因發(fā)生融合，能直接影響下游信號(hào)傳遞，其結(jié)果是細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡與分化出現(xiàn)障礙，最終引起癌癥的發(fā)生。此外，基因融合還可能會(huì)激活原癌基因、失活抑癌基因[4]，導(dǎo)致癌癥發(fā)生。 |
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| 因此，融合基因與癌癥的發(fā)生存在比較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，深入研究基因融合事件可以有效預(yù)防癌癥，或進(jìn)行精確診斷。此外，雖然基因融合的發(fā)生率相對(duì)于其他種類的突變類型較低，但相關(guān)靶向藥物的療效卻很顯著。基于此，NCCN指南已建議對(duì)多個(gè)融合基因進(jìn)行檢測分析。 |
| 與傳統(tǒng)的RT-PCR、熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）等檢測技術(shù)相比，NGS技術(shù)由其更高的實(shí)驗(yàn)通量、特異性和靈敏度，在未知融合基因、低表達(dá)基因融合事件的發(fā)現(xiàn)中具備更廣袤的應(yīng)用前景，推動(dòng)了融合基因檢測進(jìn)入新時(shí)代。 |
| 對(duì)融合基因的NGS檢測，既可以采用DNA-Seq，也可以采用RNA-Seq。雖說如此，有時(shí)在RNA水平檢出的基因融合事件卻不能在DNA水平被檢出（如剪切水平融合），如果此時(shí)只做DNA水平的融合檢測，很大可能會(huì)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。 |
| 研究表明： 在靈敏度、特異性及復(fù)雜結(jié)構(gòu)融合檢出等評(píng)價(jià)指標(biāo)中，RNA-Seq優(yōu)于DNA-Seq，能提供更準(zhǔn)確的融合基因檢測結(jié)果[5]。 |
| 所以，從RNA水平檢測融合基因并用于伴隨診斷，開始受到更多關(guān)注。 |
| 那么，哪些樣本類型在融合基因RNA-Seq項(xiàng)目中具有應(yīng)用潛力呢？ |
| 答案是FFPE和游離RNA樣本↓ |
| FFPE，即福爾馬林固定石蠟包埋樣本，是一種先用福爾馬林固定，再用石蠟包埋的臨床組織樣本。由于可在常溫情況下長期保存，全球樣本庫存有約數(shù)億份FFPE樣本，用于組織學(xué)診斷及研究使用。 |
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| 作為一種存量大、且“容易”獲取的樣本，NGS技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展賦予了FFPE樣本更大的應(yīng)用潛力，為回顧性研究、闡明疾病發(fā)病機(jī)理、Biomarker篩查、預(yù)后指示等提供了寶貴的數(shù)據(jù)。 |
| 但是，福爾馬林固定樣本時(shí)，組織中的核酸容易發(fā)生不同程度的降解與分子間交聯(lián)，石蠟的高溫滲入又進(jìn)一步加速核酸的降解，保存時(shí)間及環(huán)境對(duì)核酸也有不小影響。因此FFPE RNA常常存在完整性不足、品質(zhì)差的問題，故較難用于后續(xù)NGS分析。 |
| 再來看看游離RNA樣本。 |
| 近幾年液態(tài)活檢技術(shù)蓬勃發(fā)展，眾多第三方檢測機(jī)構(gòu)推出了基于ctDNA的腫瘤NGS服務(wù)，用于早篩、伴隨診斷、指導(dǎo)用藥。隨著研究的深入，不少從業(yè)人員又紛紛將目光聚焦游離RNA，試圖從RNA水平明確腫瘤在特定時(shí)間發(fā)生的變化、評(píng)判患者對(duì)治療的反應(yīng)等。 |
| 游離RNA，又稱cfRNA，是存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中一些內(nèi)源性或外源性微量RNA片段，包括mRNA、miRNA和lncRNA等。由于在體外易被RNA酶降解，cfRNA完整性常常較低；加之提取的cfRNA常處于微量范疇，為科研工作者NGS分析這類樣本增加難度。 |
| 面臨這兩類蘊(yùn)藏巨大價(jià)值，又困難重重的樣本，是堅(jiān)持到底，還是放棄融合基因RNA-Seq項(xiàng)目呢？ |
| 若不愿放棄，那該如何應(yīng)對(duì)呢？ |
| 小編給您支點(diǎn)招： |
| 一般建議從源頭把控，如選擇合適的核酸提取方案，以獲得足量RNA用于下游應(yīng)用；并規(guī)范樣本的取樣操作及保存條件、減少RNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。 |
| 不過，有些樣本確實(shí)比較特殊又珍貴，優(yōu)化提取方案或提升操作規(guī)范仍不能解決問題。這時(shí)還可考慮優(yōu)化文庫構(gòu)建環(huán)節(jié)。 |
| 選擇合適的文庫構(gòu)建試劑盒一般要關(guān)注： |
| 1. 靈敏性：是否支持微量RNA樣本起始，檢出更多的基因 2. 兼容性：能否兼容不同品質(zhì)的RNA樣本，如RIN值2-10的樣本 3. 重復(fù)性：結(jié)果是否可重復(fù) 4. 簡便性：rRNA去除與建庫步驟是否能順利整合、操作簡便 |
| Takara SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian（Pico v2）正是符合上述“選擇指南”的建庫試劑盒！ |
| 我們一起看看這款產(chǎn)品如何解決FFPE、cfRNA樣本降解、微量建庫的難題。 |
| 首先，Picov2支持250 pg-10 ng 人、大/小鼠total RNA，或5-50 ng FFPE RNA起始，即使珍貴的微量臨床樣本，也無需過于擔(dān)心樣本量不足。 |
| 其次，Picov2采用隨機(jī)引物，支持RIN2-10，或DV200≥25%的RNA起始，無論是品質(zhì)較好還是高度降解的FFPE、cfRNA樣本，都能生成優(yōu)質(zhì)的文庫。 |
| 最后，Picov2還創(chuàng)新性的引入了ZapR Rprobes探針加酶法的核糖體去除技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在建庫過程中識(shí)別、切斷核糖體來源的cDNA，而無需您前處理rRNA，最終可在6h內(nèi)完成鏈特異性Illumina文庫的構(gòu)建。 |
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| 來看兩個(gè)實(shí)際的應(yīng)用案例： |
| ■ FFPE RNA-Seq實(shí)驗(yàn)案例 |
| 為了探討Picov2能否應(yīng)對(duì)不同起始量、不同降解程度的FFPE RNA建庫，Takara科學(xué)家選取了4例FFPE來源的RNA樣本（起始量為10-90 ng，DV200值在28%-68%之間），采用Picov2制備文庫，并獲得如下測序數(shù)據(jù)：↓ |
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| （實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來源：Takara Bio USA, Inc.） |
| 從數(shù)據(jù)中我們可以看出，①無論RNA起始量高低，或降解是否嚴(yán)重，Picov2均能獲得約10000的轉(zhuǎn)錄本檢出數(shù)（FPKM≥1），說明Picov2具備足夠高的靈敏度；②同一樣本不同起始量之間數(shù)據(jù)的相關(guān)性系數(shù)達(dá)到0.99，說明Picov2所制備的文庫具備高度的可重復(fù)性；③再來看看rRNA的殘留情況，依照降解程度不同，rRNA殘留有所差異，但整體保持在5~16%左右，處于較低的水平，說明ZapR Rprobes技術(shù)可以有效去除rRNA干擾！ |
| 因此，使用Picov2可成功制備降解嚴(yán)重的FFPE RNA文庫，用于下游NGS分析，如融合基因分析等。 |
| ■ cfRNA-Seq文獻(xiàn)案例 |
| 不同樣本來源的cfRNA，不光在提取收量上有所差異，其分子特性也區(qū)別甚大，這就需要建庫試劑盒具備兼容不同來源cfRNA的能力。 |
| 來自根特大學(xué)的科研人員與Biogazelle公司合作開展一項(xiàng)研究[6]，探討不同來源的cfRNA分子特性的差異。科研人員選取含血小板血漿（ePRP）、不含血小板血漿（ePFP）、細(xì)胞培養(yǎng)上清（CM）、尿液（urine）、及上述幾種體液分離的細(xì)胞外囊泡，提取RNA并采用Picov2構(gòu)建文庫、測序↓ |
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| 結(jié)果顯示，不同樣本來源的cfRNA，測序reads分布有明顯差異。其中，含血小板血漿cfRNA超過75% reads比對(duì)到線粒體來源RNA，而不含血小板血漿cfRNA絕大多數(shù)reads比對(duì)到細(xì)胞核DNA。并且，不同類型cfRNA的內(nèi)含子、外顯子、基因間隔區(qū)的reads占比也有較大不同。 |
| 這些結(jié)果表明：面對(duì)不同樣本提取的cfRNA，Picov2都可以勝任文庫構(gòu)建的任務(wù)！ |
| 看到這里，相信大家對(duì)融合基因的應(yīng)用潛能，F(xiàn)FPE RNA和cfRNA的建庫方案已有了初步的認(rèn)識(shí)，或許現(xiàn)在就想用Picov2助力RNA-Seq項(xiàng)目的研發(fā)。 |
| 先別著急！ |
| 近期，Takara對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了升級(jí)，推出了Picov3。在保留Picov2可靠性能的基礎(chǔ)上，Picov3加入了UMI分子標(biāo)簽，更適合從RNA水平檢測罕見融合基因、低頻突變等應(yīng)用。 |
| 大家如果對(duì)低頻變異、結(jié)果準(zhǔn)確度有更高要求，不妨關(guān)注帶UMI的Picov3。 |
| 點(diǎn)擊文末鏈接就可以詳細(xì)了解Picov3的介紹、性能數(shù)據(jù)等內(nèi)容。 |
| 參考文獻(xiàn)及信息來源： |
| [1] 曹毛毛，陳萬青. 中國惡性腫瘤流行情況及防控現(xiàn)狀[J].中國腫瘤臨床, 2019 [2] 2020國內(nèi)NGS腫瘤伴隨診斷市場報(bào)告，搜狐網(wǎng), 2020-09-23 [3] Nicola Valeri. Streamlining detection of fusion genes in colorectal cancer: Having “Faith” in precision oncology in the (Tissue) “Agnostic” era [J]. Cancer Res 2019;79:1041-1043 [4] Tomlins S A, Rhodes D R, Perner S, et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer [J]. Science, 2005, 310(5748): 644-648 [5] Davies, K.D. & Aisner, D.L. Wake up and smell the fusions: Single-modality molecular testing misses drivers. Clin Cancer Res 25, 4586-4588 (2019) [6] Everaert, C. et al. Performance assessment of total RNA sequencing of human biofluids and extracellular vesicles. Sci. Reps.9, 17574 (2019) |
| 文末指路：點(diǎn)擊直通帶UMI的RNA-Seq建庫方案 |
頁面更新：2020-12-31 07:59:09
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