| 酵母雙雜交實驗知多少？ Takara帶您解密Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統(tǒng)！ |
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| 在蛋白質(zhì)相互作用研究工作中，酵母雙雜交技術(shù)往往是很多研究者的科研利器。然而酵母雙雜交實驗的流程相對復(fù)雜，許多剛剛開展實驗的老師很容易遇到各種各樣的問題，不知道該如何應(yīng)對。Takara將帶您解密Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統(tǒng)，將收集匯總的酵母雙雜交實驗常見問題和應(yīng)對方法分享給大家！以此為您的實驗保駕護航，再無后顧之憂！ |
| Matchmaker® Gold酵母雙雜交系統(tǒng)相關(guān)問題解答 |
| 問1：為什么要使用酵母表達系統(tǒng)來進行蛋白質(zhì)互作研究？ |
| 答1：酵母可以提供一個體內(nèi)真核系統(tǒng)，同時又兼具原核細菌系統(tǒng)的可操作性強、簡單易用的優(yōu)點。在酵母體內(nèi)表達的蛋白質(zhì)可以正確的折疊；提供中性pH內(nèi)部環(huán)境；可以形成二硫鍵和其他真核系統(tǒng)共有的翻譯后修飾。這些特點對于維持天然蛋白結(jié)構(gòu)獲得真實的蛋白質(zhì)互作關(guān)系至關(guān)重要。同時，酵母可操作性強，并且已進行全基因組測序。利用同源重組可以很方便地直接在酵母中構(gòu)建文庫。 |
| 問2：用于酵母雙雜交篩選的bait蛋白質(zhì)有什么要求？ |
| 答2：Bait蛋白質(zhì)應(yīng)該是核蛋白質(zhì)或胞漿蛋白質(zhì)；分泌型蛋白質(zhì)不能用作bait；通常來講，bait不能帶有跨膜結(jié)構(gòu)域；bait和prey的互作不能依賴于糖基化，這是由于酵母翻譯后修飾不包括糖基化；bait與GAL4 BD域融合表達后可以正確的折疊；bait不能激活酵母中轉(zhuǎn)錄報告基因的表達（即不能有自激活活性）。 |
| 問3：可以用于酵母雙雜交實驗的bait多大比較合適？ |
| 答3：以經(jīng)驗來看，bait不宜過大，過大的外源性融合蛋白在酵母中不穩(wěn)定，我們推薦bait不超過100 kD，或bait載體的DNA插入片段不超過3 kb。大多數(shù)情況下，bait的設(shè)計依賴于經(jīng)驗，很難確定bait的效果會如何。酵母雜交中插入片段的N端與147個氨基酸的GAL4 BD融合表達，這可能會影響蛋白折疊，以及插入的結(jié)構(gòu)域能否進行蛋白質(zhì)互作。比較大的bait可能會引起非特異性互作而提高背景，推薦使用較小的、特異的bait進行酵母雙雜交實驗。小至8個氨基酸，大至750個氨基酸的蛋白都已經(jīng)被成功用于酵母雙雜交研究。 |
| 問4：什么是bait蛋白質(zhì)自激活？為什么需要驗證bait的自激活活性？該如何解決？ |
| 答4：如果bait是真核轉(zhuǎn)錄因子，有可能在不需要與prey互作的情況下就可以激活酵母報告基因的表達，這就是自激活。 可以通過檢測bait菌株是否可以在含有AbA的選擇性培養(yǎng)基上生長來進行驗證。如果你的bait可以激活報告基因，你依然可以進行酵母雙雜交，不過首先需要去除轉(zhuǎn)錄激活域?？梢酝ㄟ^基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域，然后重新檢測其是否自激活。但是要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。 |
| 問5：酵母文庫可以反復(fù)凍融使用嗎？ |
| 答5：一般來說，保存于25%甘油的酵母菌株在每次解凍后會丟失10%的活力細胞。因此，大多數(shù)凍存的酵母在融化溫度不超過室溫而且操作小心的條件下，最多可容忍10次凍融。有兩個例外情況請注意：預(yù)制的酵母文庫和酵母感受態(tài)細胞。為篩選到基因覆蓋度最廣的文庫，預(yù)制的酵母文庫一旦解凍，就必須立即使用且不要重新凍存。同樣，為得到最高轉(zhuǎn)化效率，酵母感受態(tài)細胞應(yīng)該立即使用且避免凍存。 |
| 問6：使用Matchmaker系統(tǒng)做酵母雙雜交，轉(zhuǎn)化效率很低（沒有做對照實驗），這是什么原因？ |
| 答6：先建議做對照實驗；DNA質(zhì)量一定要高，可以用乙醇再次純化；DMSO和Carrier DNA質(zhì)量要高，最好是新鮮的，Carrier DNA在轉(zhuǎn)化之前最好用沸水變性；SD培養(yǎng)基pH值應(yīng)調(diào)為5.8，YPDA應(yīng)調(diào)為6.5。重新配制培養(yǎng)基，檢測對照的轉(zhuǎn)化效率；可能是BD載體翻譯出來的融合蛋白質(zhì)對酵母菌有毒性。 |
| 酵母培養(yǎng)相關(guān)問題解答 |
| 問7：為什么酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)有時會變成粉紅色或紅色？ |
| 答7：ADE2或ADE1菌株在低含量腺嘌呤培養(yǎng)基上生長時嘌呤前體積累造成菌株變紅。 Takara的YPDA培養(yǎng)基采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，可以在很大程度上避免色素的積累。 |
| 問8：固體培養(yǎng)基不凝固，是什么原因造成的？ |
| 答8：瓊脂添加量正確的情況下，培養(yǎng)基不凝固可能是由于滅菌時間過長和pH值偏低造成的。部分地區(qū)的水質(zhì)偏酸，這種情況下，建議調(diào)整SD基本培養(yǎng)基的pH值至5.8，YPDA培養(yǎng)基的pH值至6.5，在121℃的條件下，15 min高壓滅菌。 |
| 問9：可以采用X-Gal而不是X-Alpha-Gal進行Matchmaker Gold系統(tǒng)藍白斑篩選嗎？ |
| 答9：不可以，X-Gal與X-Alpha-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反應(yīng)底物，而X- Alpha -Gal是酵母α-半乳糖苷酶（Mel1p）的反應(yīng)底物。X-Alpha-Gal在Matchmaker Gold系統(tǒng)中用作藍白篩選的篩選底物，在蛋白質(zhì)互作激活mel1基因表達后，酵母細胞可以分泌表達Mel1p。 |
| 問10：做酵母 mating實驗的最佳時間是多久？需要注意什么？ |
| 答10：酵母mating實驗一般需要20-24小時。我們推薦通過檢測到顯微鏡下的三葉草結(jié)構(gòu)作為酵母接合反應(yīng)成功的根據(jù)，一般的酵母接合效率為2-5%左右。 當對誘餌菌株進行液體培養(yǎng)過夜時，應(yīng)挑選大的、新鮮的克隆進行培養(yǎng)，經(jīng)過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數(shù)，提高雜交效率。進行mating實驗時，需要低速搖菌30-50 rpm條件下培養(yǎng)，20 h后顯微鏡下觀察是否有接合反應(yīng)發(fā)生，若沒有繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 |
頁面更新：2021-04-28 09:24:46
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