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抗生素抗性基因研究與高通量qPCR技術(shù)
 
發(fā)現(xiàn)和使用抗生素，是二十世紀(jì)醫(yī)療領(lǐng)域兩大重要突破?？股氐氖褂蔑@著降低了人類發(fā)病率和死亡率。同時，抗生素與其他抗菌劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，如畜牧業(yè)，水產(chǎn)養(yǎng)殖等。
 
抗生素可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、阻礙DNA、RNA或蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌的代謝生長。面對抗生素，細(xì)菌也有應(yīng)對的辦法，如阻止抗生素滲透細(xì)胞壁、表達(dá)出外排系統(tǒng)加速抗生素排除到細(xì)胞外[1-3]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或轉(zhuǎn)化等途徑吸收外源DNA，獲得抗生素抗性基因（ARGs）[4，5]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)移動遺傳元件（MGE），如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件、整合子等，在細(xì)菌抗性基因轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[6，7]。這些遺傳元件所編碼出的酶，其主要功能包括對抗生素修飾或使其失活、組成外排系統(tǒng)、對催化位點(diǎn)的修飾等[8]。在這些功能作用下，進(jìn)一步加快了細(xì)菌獲得抗生素抗性。
 
這些抗生素抗性基因一旦進(jìn)入到與人類相關(guān)的病原體系統(tǒng)中，將會對人們的生活造成嚴(yán)重影響，如多抗性細(xì)菌病原體導(dǎo)致的院感問題。多項研究顯示，抗生素抗性基因在各種不同的生態(tài)系統(tǒng)中是廣泛存在，從土壤、水體、人類腸道，到一些極端環(huán)境中，如永久凍土，都有它的身影[9]?？股乜剐曰虻挠绊懯艿搅嗽絹碓蕉嗟年P(guān)注，對其進(jìn)行追蹤監(jiān)測也變得十分必要[10]。目前已有上千種抗生素抗性基因得到鑒定，可以賦予細(xì)菌對上百種抗生素產(chǎn)生抗性。傳統(tǒng)的qPCR方法無法輕松高效地應(yīng)對如此大規(guī)模的研究。高通量技術(shù)為抗生素抗性基因研究帶來了極大的便利，應(yīng)用在抗生素抗性基因研究中的高通量技術(shù)包括微陣列雜交芯片、宏基因組測序，以及高通量qPCR[11]。
 
微陣列雜交芯片在檢測通量方面具備優(yōu)勢。在一張芯片上可以對上千個抗性基因進(jìn)行分析。但微陣列雜交芯片在實際的應(yīng)用中會受到批間差的影響，檢測的靈敏度和特異性相對較低。所獲得的數(shù)據(jù)往往還需要額外的qPCR實驗對其進(jìn)行二次驗證[12，13]。宏基因組測序同樣具備高通量的優(yōu)勢，并且可以實現(xiàn)對未知序列的分析。但作為一種測序技術(shù)，宏基因組測序同樣需要一系列文庫構(gòu)建過程，以滿足測序設(shè)備所需要的起始量要求。對測序結(jié)果的解析可能需要復(fù)雜的生物信息學(xué)工具，整體要求較高。
 
與前兩種技術(shù)相同，高通量qPCR技術(shù)同樣可以滿足抗生素抗性基因研究的通量要求。此外，高通量qPCR技術(shù)對樣本質(zhì)量要求相對友好，可以執(zhí)行納升體系的檢測反應(yīng)，所需樣本量和試劑耗材較少。Waseem等人[11]通過薈萃分析對截至2018年10月發(fā)表過的抗生素抗性和高通量qPCR相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了研究。在最終篩選得到51篇發(fā)表文獻(xiàn)中，38篇通過SmartChip Real Time PCR System完成。
 
與前兩種技術(shù)相同，高通量qPCR技術(shù)同樣可以滿足抗生素抗性基因研究的通量要求。此外，高通量qPCR技術(shù)對樣本質(zhì)量要求相對友好，可以執(zhí)行納升體系的檢測反應(yīng)，所需樣本量和試劑耗材較少。Waseem等人[11]通過薈萃分析對截至2018年10月發(fā)表過的抗生素抗性和高通量qPCR相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了研究。在最終篩選得到51篇發(fā)表文獻(xiàn)中，38篇通過SmartChip Real Time PCR System完成。
 
SmartChip系統(tǒng)作為高通量qPCR平臺的代表之一，通過自動化微量液體操作和微孔芯片技術(shù)結(jié)合的方式，在一次實驗中即可完成上千個定量PCR反應(yīng)。憑借靈活的操作方式，在抗生素抗性基因研究領(lǐng)域發(fā)揮了強(qiáng)大的作用。
 
SmartChip系統(tǒng)熒光定量PCR實驗流程示意圖
 
MyDesign芯片是SmartChip系統(tǒng)重要的耗材之一。MyDesign芯片表面按72×72的方式排布了5,184個納升體積微孔，可進(jìn)行100 nl體系的定量PCR反應(yīng)。
 
MyDesign芯片
 
目前，SmartChip系統(tǒng)檢測過抗生素抗性相關(guān)基因384種，涉及土壤、水源、沉淀（沉積）物、糞便、污泥等多種樣品類型。與高通量測序技術(shù)一起，成為抗生素抗性基因研究領(lǐng)域第一梯隊的重要成員。
 
表一 SmartChip系統(tǒng)檢測過的抗生素抗性相關(guān)基因。
抗生素抗性相關(guān)基因 檢測引物數(shù)量
Tetracycline（四環(huán)素） 30
Trimethoprim（甲氧芐啶） 19
Vancomycin（萬古霉素） 22
Aminoglycoside（氨基糖苷類抗生素） 60
Amphenicol（酰胺醇類抗生素） 19
Beta-lactamase（β-內(nèi)酰胺酶） 56
Fluoroquinolone（氟喹諾酮） 11
Sulfonamide（磺酰胺） 7
Mobile genetic elements（移動遺傳元件） 52
Multidrug resistance（多重耐藥性） 48
數(shù)據(jù)來自Takara Bio USA, Inc.網(wǎng)站
 
抗生素抗性基因研究與人類健康息息相關(guān)。SmartChip Real Time PCR System將憑借其靈活自由、高通量的優(yōu)勢助力科研人員取得更多研究發(fā)現(xiàn)！
 
【參考文獻(xiàn)】
[1] Davies J, Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. Science 264: 375-382 (1994)
[2] Rybak M J, Resistance to antimicrobial agents: an update. Pharmacotherapy 24: 203S-215S (2004)
[3] Sheldon A T Jr, Antibiotic resistance: a survival strategy. Clin Lab Sci 18: 170-180 (2005)
[4] Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environment. Plasmid 42: 73-91 (1999)
[5] Thomas C M, Nielsen K M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nat Rev Microbiol 3: 711-721 (2005)
[6] Toussaint A, Merlin C. Mobile elements as a combination of functional modules. Plasmid 47: 26-35 (2002)
[7] Frost L S et al. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution. Nat Rev Microbiol 3: 722-732 (2005)
[8] Mazel D, Davies J. Antibiotic resistance in microbes. Cell Mol Life Sci 56: 742-754 (1999)
[9] Martínez J L et al. What is a resistance gene Ranking risk in resistomes. Nat Rev Microbiol 13: 116-123 (2015)
[10] World Health Organization. Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance. (2014)
[11] Waseem H, et al. Contributions and challenges of high troughput qPCR for determining antimicrobial resistance in the environment: A critical review. Molecules 24: 163 (2019)
[12] Jeanty C, et al. An optimized protocol for microarray validation by quantitative PCR using amplified amino allyl labeled RNA. BMC Genomics 11: 542 (2010)
[13] Morey J S, et al. Microarray validation: Factors influencing correlation between oligonucleotide microarrays and real-time PCR. Bio Proced Online 8: 175-193 (2006)
 
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高通量Real Time PCR系統(tǒng)——SmartChip Real Time PCR System
 

頁面更新：2021-04-30 14:11:18