| 悟了，要想微生物組測(cè)序不難搞，選對(duì)方法很關(guān)鍵！ | ||
| 微生物雖然微小，但不可否認(rèn)的是它們無處不在，與人類有著十分密切的關(guān)系。一方面我們與很多微生物和諧相處，比如腸道益生菌。而另一方面大量的病原微生物也給人類的健康甚至生命帶來了巨大的威脅。因此，我們對(duì)微生物的研究始終都未曾停止過。 主要的研究方法包括經(jīng)典的培養(yǎng)鑒定法、血清學(xué)檢測(cè)、微生物核酸檢測(cè)（如RT-PCR法）以及NGS分析等多種方法。其中相較于傳統(tǒng)方式，NGS技術(shù)可以對(duì)疑難微生物以及難以培養(yǎng)的菌屬進(jìn)行核酸序列的測(cè)定（特別是在新型病原微生物流行監(jiān)測(cè)方面），并且在檢測(cè)時(shí)間、通量上具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，因此逐漸成為微生物研究領(lǐng)域的重要方法。 |
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| mNGS，也稱宏基因組測(cè)序技術(shù)，是研究環(huán)境或人體等樣本中所有以DNA為基因組的微生物遺傳物質(zhì)的技術(shù)，它的發(fā)展開啟了微生物研究的新時(shí)代。這種技術(shù)不依賴微生物分離培養(yǎng)，可直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行檢測(cè)，分析微生物群落、以及微生物與宿主之間的相互關(guān)系。 | ||
| ThruPLEX DNA-Seq Kit，實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣品的可靠宏基因組分析 | ||
| 在某些情況下，以非常少量的臨床樣本作為研究對(duì)象進(jìn)行宏基因組分析是難免的，這類樣本包括臨床拭子、體液、少量組織等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始，單管操作、手動(dòng)15 min、總共兩小時(shí)，過程中無需轉(zhuǎn)管與純化，輕松應(yīng)對(duì)宏基因組建庫(kù)難題！ | ||
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| ■ 文獻(xiàn)案例 | ||
| 皮膚是人體最大的器官，“網(wǎng)羅”了各種各樣的微生物。多年來，雖然科研人員對(duì)涉及皮膚內(nèi)穩(wěn)態(tài)的微生物群落研究有了一些進(jìn)展，但對(duì)皮炎與微生態(tài)失衡之間是否關(guān)聯(lián)知之甚少。瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的Dr. Nanna Fyhrquist團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章，采用宏基因組學(xué)結(jié)合16s rRNA測(cè)序、宿主轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析技術(shù)，探討過敏性皮炎、銀屑病及健康人皮膚表面微生物群落特征，并與宿主皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。 結(jié)果顯示，過敏性皮炎與銀屑病皮膚樣品具有各自特有的微生物群落特征，并都與健康人樣本的數(shù)據(jù)存在差異。其中，過敏性皮炎樣本的優(yōu)勢(shì)菌為Staphylococcus aureus，與皮膚屏障功能、色氨酸代謝及免疫激活等宿主轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有相關(guān)性；銀屑病樣本顯示出共生的微生物群落結(jié)構(gòu)，并與宿主疾病相關(guān)基因的表達(dá)存在弱相關(guān)性。 |
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| 盡管mNGS 用于病原微生物檢測(cè)具有諸多優(yōu)勢(shì)，但其技術(shù)上往往還面臨著一些挑戰(zhàn)：比如，樣本中宿主（例如人源）核酸的干擾。由于宿主基因組大小很可能遠(yuǎn)大于微生物的基因組，目標(biāo)基因片段在整體樣本中的含量較低，不僅會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)成本偏高，甚至?xí)霈F(xiàn)目標(biāo)基因片段太小而無法正確鑒定的假陰性結(jié)果。 針對(duì)上述這種情況，可以選擇采用多重PCR（multiplex PCR）測(cè)序。在提高靈敏度的前提下，可以大大減少測(cè)序數(shù)據(jù)量，實(shí)現(xiàn)性能及成本的雙優(yōu)化。 Tip: 多重PCR也稱復(fù)合PCR，它是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。它的基本原理與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR是在反應(yīng)體系中加入了兩對(duì)以上引物，各對(duì)引物分別結(jié)合在模板相對(duì)應(yīng)部位，最終擴(kuò)增出兩條以上目的DNA片段。 |
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| >> 多重PCR測(cè)序的操作流程 | ||
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| >>多重PCR的優(yōu)勢(shì) | ||
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| 但多重PCR要想實(shí)現(xiàn)較好的擴(kuò)增性能，需要考慮反應(yīng)多方條件，具有較高的技術(shù)壁壘，而其中多重PCR酶的選擇也是重中之重，所以這里“墻裂”推薦↓ | ||
| Multiplex PCR Assay Kit Ver.2 | ||
| 它是由能快速進(jìn)行Priming的酶與能很好提高引物退火特異性的反應(yīng)液配套組成的Multiplex PCR用試劑盒。同以往Multiplex PCR Enzyme相比，可在短時(shí)間內(nèi)特異性地進(jìn)行無偏差的PCR擴(kuò)增。另外，調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間也可對(duì)大約200對(duì)引物進(jìn)行Multiplex PCR。 | ||
| ■ 更加高效完成多重PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)例 | ||
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| ■ 多重PCR測(cè)序的實(shí)驗(yàn)例 | ||
| 使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 和本產(chǎn)品、以人基因組DNA為模板對(duì)207個(gè)目的基因進(jìn)行Multiplex PCR，制備文庫(kù)后進(jìn)行NGS測(cè)序。 | ||
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| *The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2× the average base read depth. | ||
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| 結(jié)果顯示，通過對(duì)約500萬reads進(jìn)行測(cè)序，得到207個(gè)目的基因全部為500個(gè)reads以上，確認(rèn)全部的目的基因可以被正確擴(kuò)增！ | ||
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| 我們相信，選擇合適的方法和試劑，會(huì)讓您的mNGS實(shí)驗(yàn)事半功倍。 | ||
頁(yè)面更新：2022-08-30 15:18:28
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