| Takara病毒基因?qū)胂到y(tǒng)全套解決方案 |
| 病毒基因?qū)胂到y(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)眾多研究領(lǐng)域，在被寄予厚望的細(xì)胞和基因治療研究中，病毒基因?qū)肫脚_(tái)也已經(jīng)成為主要的基因?qū)胧侄巍?
目前常用的病毒載體包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒等等，這些病毒載體各有特點(diǎn)，使用也有所不同，需要根據(jù)目標(biāo)對(duì)象（培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物個(gè)體）、希望的基因表達(dá)方式（瞬時(shí)，穩(wěn)定），結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的病毒載體。 今天為大家介紹幾個(gè)病毒基因?qū)肫脚_(tái)的異同。 |
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| ◇ 慢病毒(Lentivirus) |
| 慢病毒是目前使用較多的病毒基因?qū)胂到y(tǒng)，也是細(xì)胞與基因療法研究，尤其是CAR-T治療，所使用的主要基因?qū)肫脚_(tái)。慢病毒是單鏈RNA病毒，一般以人免疫缺陷病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的居多，可用于絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因?qū)?，包括使用逆轉(zhuǎn)錄病毒難以實(shí)現(xiàn)的造血干細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等在內(nèi)的非分裂細(xì)胞。使用重組慢病毒導(dǎo)入的目的基因也可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)。 |
| 慢病毒表達(dá)載體 |
| 慢病毒表達(dá)載體是所有慢病毒基因?qū)胂到y(tǒng)的關(guān)鍵參與者。野生型慢病毒基因組約為9.7 kb（包含兩個(gè)LTR）。人工構(gòu)建大于此長(zhǎng)度的基因組，將導(dǎo)致產(chǎn)生不穩(wěn)定的病毒粒子和病毒滴度的明顯下降。對(duì)于慢病毒表達(dá)載體來(lái)說(shuō)，大部分病毒基因組已經(jīng)被其他有用的序列所取代，如篩選標(biāo)記或熒光蛋白質(zhì)基因，但仍有足夠的空間用于目的基因克隆。 由于每個(gè)慢病毒表達(dá)載體含有的有用序列不同，因此克隆轉(zhuǎn)基因的可用空間也有所不同。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的慢病毒表達(dá)載體，除了含有HIV-1 LTR和慢病毒包裝信號(hào)（Ψ），也會(huì)包含一些特定元件（cPPT/CTS，RRE，WPRE），這些特定元件的存在有助于改善轉(zhuǎn)基因表達(dá)、病毒滴度和整體慢病毒載體功能。 |
| 慢病毒包裝制備 |
| 使用重組慢病毒的生物安全問(wèn)題是，可能會(huì)產(chǎn)生致癌病毒或具有復(fù)制能力的重組慢病毒(RCL)。然而這些擔(dān)憂，可以通過(guò)仔細(xì)考慮轉(zhuǎn)基因插入物的性質(zhì)，并確保病毒復(fù)制僅限于發(fā)生在提供這些基本功能的特定包裝細(xì)胞中，而得到大大緩解。因此，重組慢病毒可以安全使用，是將外源性遺傳物質(zhì)單向轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的有用工具。 重組慢病毒的包裝細(xì)胞一般為HEK 293T細(xì)胞，選擇易于轉(zhuǎn)染并能夠高水平表達(dá)病毒蛋白的HEK 293T細(xì)胞，更有利于獲得高病毒滴度。就慢病毒包裝系統(tǒng)而言，目前市面上主要是第三代和第四代慢病毒包裝系統(tǒng)，大家了解較多的是第三代包裝系統(tǒng)，對(duì)第四代系統(tǒng)了解較少。 以Lenti-X™第四代慢病毒包裝系統(tǒng)為例，這款包裝系統(tǒng)Tet-Off和Tat反式激活因子驅(qū)動(dòng)病毒必需成分高水平表達(dá)，誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)表達(dá)反應(yīng)，從而可以制備出高滴度慢病毒，VSV-G型包裝系統(tǒng)病毒滴度可達(dá)到107–108 IFU/ml。另外，pol基因與vpr基因的融合可以確保反轉(zhuǎn)錄酶/整合酶蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)到重組慢病毒顆粒中。 |
| 慢病毒一般實(shí)驗(yàn)流程 |
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| ◇ 逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus) |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒也是單鏈RNA病毒，一般基于莫羅尼小鼠白血病病毒（MoMLV）開(kāi)發(fā)。逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠?qū)⒒驅(qū)胫炼鄶?shù)處于增殖期的細(xì)胞中，由于導(dǎo)入基因可整合到染色體中，因此可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備相對(duì)容易，但仍然需要在P2級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下操作。逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因治療方面有著豐富的應(yīng)用實(shí)績(jī)，但由于它相對(duì)慢病毒更容易引起插入性隨機(jī)突變，近幾年來(lái)應(yīng)用較少。 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 |
| 野生型莫羅尼小鼠白血病病毒（MMLV）基因組約8.2 kb（包括兩個(gè)LTR）。人工構(gòu)建一個(gè)大于8.2 kb的基因組，同樣也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生不穩(wěn)定的病毒粒子和病毒滴度的下降。與慢病毒表達(dá)載體相類似，大部分病毒基因組已被其他有用的序列（如篩選標(biāo)記或熒光蛋白基因）取代，但仍有足夠的空間用于克隆轉(zhuǎn)基因。由于不同逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體包含的有用序列不同，因此用于克隆轉(zhuǎn)基因的可用空間也不同。 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝制備 |
與慢病毒相似，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒也會(huì)有產(chǎn)生RCL的可能性，所以逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒也會(huì)進(jìn)行特別設(shè)計(jì)。病毒包裝用質(zhì)粒上插入有逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)基因，gag-pol和env基因，這兩種基因是逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建和復(fù)制所必需的基因，但是質(zhì)粒上缺少包裝信號(hào)Ψ序列和LTR序列，因此包裝用質(zhì)粒本身是無(wú)法包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒的，只有將其和包含Ψ序列和LTR序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到293或者293T包裝細(xì)胞中，才能包裝得到逆轉(zhuǎn)錄病毒，產(chǎn)生具有自我復(fù)制能力逆轉(zhuǎn)錄病毒的幾率也非常低。 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒一般實(shí)驗(yàn)流程 |
以穩(wěn)定表達(dá)gag和pol基因的GP2-293包裝細(xì)胞為例。 |
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| ◇ 腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus） |
由于腺相關(guān)病毒（AAV）免疫原性和細(xì)胞毒性低，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，并且整合到宿主基因組中的頻率非常低，因此被眾多研究學(xué)者認(rèn)為安全性更高。經(jīng)過(guò)重組和改造的AAV擁有不同的血清型，根據(jù)血清型不同而具有不同的宿主范圍和病毒特征，可以有效作用于特定細(xì)胞類型，包括分裂和非分裂細(xì)胞類型。使用者需要根據(jù)靶標(biāo)細(xì)胞或者組織類型選擇適合的血清型。目前使用頻率較高的血清型為AAV2，其它血清型也逐漸被廣泛使用。 |
AAV基因組結(jié)構(gòu) |
AAV基因組是約4.7 kb的單鏈線狀DNA分子，在兩端都有被稱為反向末端重復(fù)序列（ITR）的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ITR的功能在于基因組復(fù)制起始位點(diǎn)及輔助病毒粒子包裝。AAV基因組包含了3個(gè)開(kāi)放閱讀框：Rep編碼參與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)；Cap編碼病毒衣殼蛋白質(zhì)；AAP編碼用于病毒粒子形成的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。Rep區(qū)域編碼4種不同的蛋白質(zhì)（Rep78, Rep68, Rep52和Rep40，Cap區(qū)域編碼3種不同的蛋白質(zhì)（VP1, VP2 和 VP3 ）。 |
AAV包裝制備 |
一般來(lái)說(shuō)，AAV只有在輔助病毒（如腺病毒或皰疹病毒）存在下才能復(fù)制。目前，AAV的包裝制備大多使用無(wú)輔助病毒包裝系統(tǒng)，也就是在不使用輔助病毒的情況下制備重組AAV。AAV的制備也是通過(guò)將編碼重組AAV所需因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞來(lái)完成的。制備AAV載體一般需要以下3種質(zhì)粒：含有目的基因表達(dá)框和2個(gè)ITR的質(zhì)粒，包含AAV2 Rep基因和各種血清型Cap基因的質(zhì)粒，包含腺病毒E2A、E4、VA基因的質(zhì)粒。 |
AAV一般實(shí)驗(yàn)流程 |
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| ◇ 腺病毒（Adenovirus） |
腺病毒是將基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的可靠平臺(tái)之一。腺病毒的感染不依賴于細(xì)胞周期，所以可以將目標(biāo)基因傳遞給原代或者經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。在感染后細(xì)胞中，由于重組腺病毒基因組以多拷貝形式存在，目標(biāo)基因?qū)⒁愿咚剿矔r(shí)表達(dá)，腺病毒具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效生產(chǎn)蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)。此外，腺病毒能夠感染多種不同動(dòng)物物種的增殖和靜止細(xì)胞類型，適用范圍廣。 |
腺病毒表達(dá)載體 |
腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，目前多使用人5型腺病毒，這種病毒DNA基因組約36 kb，基因組兩端包含反向末端重復(fù)序列(ITR)。常用的腺病毒表達(dá)載體，刪除了早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因E1和E3。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒載體可插入約8 kb的外源基因。由于腺病毒載體大，克隆難度也高。傳統(tǒng)方法是借助穿梭載體作為中間過(guò)渡，首先將目的基因克隆到穿梭載體，然后再重組到腺病毒病毒DNA上；當(dāng)然也可以借助先進(jìn)的克隆技術(shù)（In-Fusion®等）一步完成，高效方便。 |
腺病毒包裝制備 |
| E1基因?qū)ο俨《镜膹?fù)制和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，E3基因的缺失不影響腺病毒的復(fù)制。所以腺病毒包裝必需依賴于表達(dá)E1基因的細(xì)胞系，比如HEK-293等。在包裝前，需要將克隆了目的基因的重組腺病毒載體線性化，以暴露位于腺病毒基因組兩端的反向末端重復(fù)序列（ITR），并從質(zhì)粒骨架釋放腺病毒基因組。原因是ITR包含腺病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)，必須位于線性腺病毒DNA分子的末端，以支持復(fù)制復(fù)合物的形成。 線性化重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK-293包裝細(xì)胞，大約一周左右可以收獲重組病毒。這部分病毒將被作為病毒種子再感染HEK-293包裝細(xì)胞，使其自我復(fù)制來(lái)獲得更高病毒滴度，再次收集病毒感染目標(biāo)細(xì)胞。 |
腺病毒一般實(shí)驗(yàn)流程 |
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| 病毒基因?qū)胂到y(tǒng)“專家“ |
| Takara Bio作為重要的生物技術(shù)企業(yè)，擁有慢病毒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒系統(tǒng)、腺病毒全套解決方案，為相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供強(qiáng)力支持，為寄予厚望的細(xì)胞與基因治療研究護(hù)航加碼。 |
| 慢病毒系統(tǒng) → Lenti-X™系列 |
慢病毒包裝系統(tǒng) Lenti-X Packaging Single Shots 第四代包裝系統(tǒng)，高滴度，一步操作 慢病毒滴度測(cè)定&濃縮 Lenti-X p24 Rapid Titer Kit – ELISA法 Lenti-X GoStix Plus - 10 min定量測(cè)定 Lenti-X Concentrator – 高達(dá)100倍濃縮 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng) RetroNectin GMP grade 已用于超過(guò)68種基因治療臨床試驗(yàn)方案 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng) → Retro-X™系列 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng) Retro-X Universal Packaging System 提供四種包膜質(zhì)粒，按需選擇 逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定&濃縮 Retro-X qRT-PCR Titration Kit - qRT-PCR法 Retro-X Concentrator – 高達(dá)100倍濃縮 逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)分析 Retro-X Integration Site Analysis Kit 確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn) |
| 腺相關(guān)病毒系統(tǒng) → AAVpro®系列 |
腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng) AAVpro Packaging Plasmid(AAV1-6) 引入hsa-miR-342，滴度增加約2倍 腺相關(guān)病毒滴度測(cè)定 AAVpro Titration Kit Ver.2– qPCR法 腺相關(guān)病毒純化和濃縮 AAVpro Purification Kit 通用型，用于從包裝細(xì)胞純化病毒 AAVpro Concentrator 通用型，用于從培養(yǎng)上清液中純化病毒 |
腺病毒系統(tǒng) → Adeno-X™系列 |
腺病毒表達(dá)系統(tǒng) Adeno-X Adenoviral System 3 無(wú)需穿梭質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)，簡(jiǎn)便易用 腺病毒滴度測(cè)定 Adeno-X Rapid Titer Kit – ELISA法 Adeno-X GoStix - 10 min半定量測(cè)定 Adeno-X qPCR Titration Kit - qPCR法 腺病毒純化 Adeno-X Purification Kit 色譜純化方法 |
《基因?qū)雽?shí)驗(yàn)操作手冊(cè)》涵蓋介紹了基因?qū)敕椒捌涮攸c(diǎn)、主要基因?qū)敕椒ǖ脑?、主要病毒載體特征、病毒載體選擇指南，眾多干貨知識(shí)盡在其中。>>點(diǎn)擊此處下載查看。 |
頁(yè)面更新：2023-01-11 14:11:01
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