欧美成 人版在线_久久免视看国产_亚洲成l人在线观看线路_久久96热在精品国产网站

我們使用cookie改善您的瀏覽體驗并提供有意義的內(nèi)容。請閱讀我們的cookie協(xié)議
收藏我們 在線訂購 CoA查詢
     

機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁 > 新聞中心
無標(biāo)題文檔
sgRNA設(shè)計、制備、篩選知多少
 
在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，如果Cas9是一把鋒利的刀，那么sgRNA就是以一個“指揮”的形象在系統(tǒng)中出現(xiàn)，引導(dǎo)Cas9靶向地對目的基因進(jìn)行敲除、插入、定點突變等編輯，使得定點基因組改變的難度明顯降低，可進(jìn)行操作的目標(biāo)生物種類大大增加。

那么，對于如此重要的基因編輯實驗元件，我們該如何對其進(jìn)行實驗前期的設(shè)計以及實驗中的制備篩選呢？
 
sgRNA設(shè)計
由于sgRNA負(fù)責(zé)將Cas9招募到特定的基因組位點進(jìn)行定向切割，因此，sgRNA的設(shè)計作為基因編輯實驗的第一步，對于實驗?zāi)芊癯晒χ陵P(guān)重要。

一個完整的sgRNA包含用戶自定義的靶向序列crRNA序列（CRISPR-derived RNA）和通用的Cas9核酸酶招募序列tracrRNA（trans-activating RNA），即sgRNA=crRNA+tracrRNA。crRNA序列是根據(jù)靶標(biāo)基因特定位點自定義設(shè)計的，是與靶標(biāo)位點同源的20個核苷酸序列，靶向不同的靶標(biāo)基因就需要設(shè)計不同的自定義crRNA序列。以使用廣泛的spCas9系統(tǒng)為例，設(shè)計sgRNA之前，應(yīng)在目標(biāo)基因組附近尋找PAM序列（PAM序列為NGG，N=A/T/C/G），基因特異的sgRNA模板序列為位于PAM序列前間區(qū)序列鄰近基序。sgRNA通過“引導(dǎo)”Cas 9蛋白，可在PAM序列上游3-4個堿基處進(jìn)行剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生雙鏈斷裂，形成目的基因突變。

因此，我們可以針對自己感興趣的基因，設(shè)計出實驗所需的sgRNA。通過以往的實驗經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)一個設(shè)計sgRNA的小技巧。當(dāng)sgRNA的第一個堿基為G，第17個堿基為A或T時，基因編輯實驗效率會有所提升。除了自己手動設(shè)計以外，現(xiàn)在也有許多網(wǎng)站可用于設(shè)計高靶標(biāo)特異性、低脫靶效應(yīng)的sgRNA。

Takara整理了用于sgRNA設(shè)計的網(wǎng)頁工具列表，歡迎點擊訪問查看！
 
sgRNA制備與篩選
在完成sgRNA的設(shè)計后，我們需要制備可以進(jìn)行高效實驗的sgRNA。但由于我們無法確定sgRNA的特異性和在實際實驗中的效率，因此，實驗中我們通常會設(shè)計多種不同的sgRNA來靶向目的基因，并從中篩選出較高實驗效率的sgRNA用于基因編輯實驗，這樣可以大大降低使用無效或者低效率sgRNA的風(fēng)險。
 
Takara Guide-it寶藏試劑盒“一站式解決”
 
 
Guide-it sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒可以用于合成您的sgRNA。使用該試劑盒，通過PCR在T7啟動子的控制下生成包含sgRNA編碼序列的模板DNA。然后，使用PCR產(chǎn)物模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生可純化并進(jìn)行效率測試或轉(zhuǎn)導(dǎo)的sgRNA。
 
Guide-it sgRNA 篩選試劑盒可以用于在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)前sgRNA 效率評估，使您能夠確定高效的sgRNA。
 
產(chǎn)品特點：
·調(diào)整了轉(zhuǎn)錄起始位點，sgRNA產(chǎn)量可達(dá)12 μg以上。
·采用PrimeSTAR Max PCR擴(kuò)增模板DNA，可減少非特異性擴(kuò)增，原則上不需要切膠回收。
·采用Clean-Up Kit柱式純化sgRNA，不需要進(jìn)行苯酚/酚氯仿抽提純化。
·采用Terra PCR Mix制備目的DNA，可以直接以細(xì)胞為起始進(jìn)行PCR。
 
實驗案例：
1. 以不同基因為靶標(biāo)制備的sgRNA產(chǎn)量和品質(zhì)比較
Panel A. 將20 μl sgRNA體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應(yīng)液置于37°C孵育4 hr，采用NanoDrop分光光度計檢測所制備產(chǎn)生的sgRNA產(chǎn)量。
Panel B. 采用安捷倫生物分析儀分析每一個sgRNA IVT反應(yīng)液，檢測sgRNA質(zhì)量。
 
2. Guide-it試劑和其他公司同類產(chǎn)品所制備的sgRNA品質(zhì)比較
采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制備的所有sgRNAs均為單一條帶，而使用其他公司同類產(chǎn)品制備的sgRNAs均可觀察到雜帶，因此Guide-it試劑盒所制備的sgRNAs品質(zhì)更高（Takara Bio USA, Inc.比較結(jié)果）。
 
3. HeLa細(xì)胞CXCR4基因體外剪切效率和體內(nèi)敲除效率比較
采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制備的所有sgRNAs均為單一條帶，而使用其他公司同類產(chǎn)品制備的sgRNAs均可觀察到雜帶，因此Guide-it試劑盒所制備的sgRNAs品質(zhì)更高（Takara Bio USA, Inc.比較結(jié)果）。
 
以敲除Hela細(xì)胞中的CXCR4靶基因為例。
 
Panel A. 通過電泳結(jié)果圖可以看出，在所制備的4條sgRNA中，3號sgRNA的體外剪切效率是最低的。
Panel B. 將4條sgRNA分別導(dǎo)入至HeLa細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，分別再使用突變檢測試劑盒和流式來檢測基因敲除效率，檢測結(jié)果顯示同樣是3號sgRNA的基因敲除效率最低。
 
以上實驗結(jié)果說明：sgRNA的體外剪切效率和體內(nèi)敲除效率之間是具有一定的相關(guān)性的。
 
632636 Guide-it™ Complete sgRNA Screening System產(chǎn)品應(yīng)用文獻(xiàn)：
[1] Khadka P, Reitman ZJ, Lu S, et al. PPM1D mutations are oncogenic drivers of de novo diffuse midline glioma formation. Nat Commun. 2022;13(1):604.
[2] Morizako N, Butlertanaka EP, Tanaka YL, et al. Generation of a bovine cell line for gene engineering using an HIV-1-based lentiviral vector. Sci Rep. 2022;12(1):16952.
[3] Mizushima S, Sasanami T, Ono T, Matsuzaki M, Kansaku N, Kuroiwa A. Cyclin D1 gene expression is essential for cell cycle progression from the maternal-to-zygotic transition during blastoderm development in Japanese quail. Dev Biol. 2021;476:249-258.
[4] Sreedurgalakshmi K, Srikar R, Harikrishnan K, Srinivasan L, Rajkumari R. Cetuximab-siRNA Conjugate Linked Through Cationized Gelatin Knocks Down KRAS G12C Mutation in NSCLC Sensitizing the Cells Toward Gefitinib. Technol Cancer Res Treat. 2021;20:15330338211041453.
 
其他關(guān)聯(lián)產(chǎn)品推薦
★ 重組Cas9蛋白質(zhì) (3 μg/μl)/(10 μg/μl)
Takara有來源于野生型釀膿鏈球菌的重組Cas9蛋白質(zhì)，助力基因編輯，錨定靶點切割！Guide-it Recombinant Cas9有多種蛋白質(zhì)濃度產(chǎn)品，可滿足電穿孔、顯微注射等多種不同復(fù)合物導(dǎo)入方式。C末端的NLS核定位信號可以實現(xiàn)快速有效的突變導(dǎo)入，且經(jīng)過不斷的產(chǎn)品優(yōu)化，已證實對哺乳動物細(xì)胞具有良好的耐受性，可降低導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞時所造成的細(xì)胞損傷，使脫靶效應(yīng)更小化的同時，更容易實現(xiàn)高效率的基因編輯。
 
★ GMP級別重組Cas9蛋白質(zhì)
為了滿足更多臨床研究試驗的需求，面向需要更高產(chǎn)品品質(zhì)的用戶，Takara提供批次差異更低的Recombinant Cas9 Protein GMP grade，即GMP級別的Cas9核酸酶，制造過程中不使用人源或動物源成分，已通過日本藥品與食品安全局（PFSB）的GMP級別標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)測試，得到生產(chǎn)許可，并在該標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行制造和品質(zhì)管理，適用于體外細(xì)胞工程和基因治療研究。
 
★ 基因編輯后突變檢測
Takara突變檢測試劑盒可以用于確認(rèn)由CRISPR/Cas9、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）等工程核酸酶所導(dǎo)入的基因突變。試劑盒采用簡單的PCR方法，即可簡便快速地檢測出基因突變。性能卓越的 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix可直接以細(xì)胞為起始進(jìn)行擴(kuò)增，無需提取基因組DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性及退火處理后形成不完全匹配DNA，Guide-it解離酶會剪切錯配DNA部分，之后通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)剪切產(chǎn)物。
 
Takara Guide-it™ 產(chǎn)品線長期致力于基因編輯實驗的解決方案！更多基因編輯相關(guān)資料歡迎您點擊下載CRISPR/Cas9基因編輯完整解決方案宣傳冊，或直接觀看在線講座視頻CRISPR/Cas9基因編輯全套操作和解決方案。
 

頁面更新：2023-01-17 15:19:48