| 誰(shuí)懂啊～ Takara這款試劑盒“一盒兩用”，快進(jìn)來(lái)看！ |
| 很多“寶粉們”想問(wèn)：基因敲入后那么多的樣品，如何初步鑒定是否發(fā)生了基因片段敲入或SNP突變呢？別急！Takara為您提供Guide-it™ Knockin Screening Kit（Code No. 632659/ 632660）試劑盒，可以幫您初步篩選樣品是否通過(guò)基因敲入產(chǎn)生了基因編輯。 |
| Guide-it™ Knockin Screening Kit試劑盒的應(yīng)用場(chǎng)景 |
| 基因編輯技術(shù)最強(qiáng)大的應(yīng)用之一是能夠在感興趣的基因組位點(diǎn)引入精確的突變。然而，這個(gè)編輯結(jié)果發(fā)生的可能性通常很低，因?yàn)樗ǔＲ蕾?lài)于一種稱(chēng)為同源定向修復(fù)（HDR）的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，該機(jī)制以相對(duì)較低的頻率發(fā)生。因此，在兩個(gè)不同的階段，檢測(cè)成功的HDR事件至關(guān)重要。第一階段涉及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以在編輯的群體中實(shí)現(xiàn)最高百分比的無(wú)錯(cuò)誤HDR事件，然后再繼續(xù)分離單細(xì)胞克隆。第二階段涉及鑒定在96孔板中進(jìn)行單細(xì)胞分離和擴(kuò)增后攜帶目標(biāo)編輯的細(xì)胞系。Guide-it Knockin Screening Kit試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單的基于熒光的方法，可用于篩選編輯的群體以及來(lái)自96孔板的克隆，用于從SNP替換到更長(zhǎng)插入的編輯，從而滿(mǎn)足了在兩個(gè)階段靈敏檢測(cè)成功HDR的需求。 |
| Guide-it™ Knockin Screening Kit試劑盒優(yōu)勢(shì)多多！ |
| ♦ 大大節(jié)省時(shí)間和精力，整個(gè)操作流程只需大約4個(gè)小時(shí)。 ♦ 操作簡(jiǎn)便，主要包括基因組靶標(biāo)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，綠色和紅色雙色熒光檢測(cè)的酶法測(cè)定。 ♦ 采用基于熒光的檢測(cè)方法，不論所敲入的插入物長(zhǎng)度（從單堿基替換到更長(zhǎng)的插入片段）或被編輯的基因組區(qū)域序列如何，都可以對(duì)基因敲入所產(chǎn)生的基因組編輯位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。 ♦ 不需特殊儀器，使用熒光讀板機(jī)或定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)即可進(jìn)行測(cè)定。 |
| 那么，為什么說(shuō)這款試劑盒有兩種作用呢？下面我們一起來(lái)看看吧！ 在進(jìn)行基因敲入后，可以產(chǎn)生長(zhǎng)片段基因敲入的編輯結(jié)果，也可以產(chǎn)生SNP突變的編輯結(jié)果。針對(duì)不同的結(jié)果，Guide-it™ Knockin Screening Kit有著不同的用途。 |
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| 圖一 |
| 如圖一：基因編輯后，通過(guò)FACS或有限稀釋法分離的大量細(xì)胞群和克隆細(xì)胞系可能表現(xiàn)出多種模式，例如野生型（WT），引入插入/缺失（indel）或敲入了全長(zhǎng)插入片段。從克隆細(xì)胞中提取DNA并擴(kuò)增靶標(biāo)位點(diǎn)，然后將PCR產(chǎn)物與兩套不同的displacement oligo（紫色）和flap probe進(jìn)行雜交：一個(gè)與插入片段的5'端雜交（Flap-probe oligo A; 綠色），另外一個(gè)與3'端雜交（Flap-probe oligo B; 紅色）。當(dāng)displacement oligo和flap probe完全與擴(kuò)增的靶標(biāo)位點(diǎn)雜交時(shí)，此時(shí)的displacement oligo和flap probe之間無(wú)gap，Guide-it Flapase會(huì)剪切flap probes從而產(chǎn)生相應(yīng)的熒光。如果同源重組成功并且全長(zhǎng)插入片段無(wú)縫正確插入的情況下，探針會(huì)與兩端完全雜交，Guide-it Flapase剪切flap probes后產(chǎn)生綠色和紅色熒光信號(hào)。當(dāng)僅檢測(cè)到一種熒光信號(hào)（紅色或綠色）時(shí)，表明插入片段分別在5'端或3'端發(fā)生了缺失。如果沒(méi)有檢測(cè)到熒光，則表明靶標(biāo)位點(diǎn)依然是野生型序列或者引入了indel。 |
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| 圖二 |
如圖二：在二倍體細(xì)胞中進(jìn)行編輯時(shí)，每個(gè)等位基因的編輯結(jié)果可能會(huì)有所不同，從而產(chǎn)生多種可能的組合。如果沒(méi)有發(fā)生基因編輯，細(xì)胞仍然可以保持純合型（Wild type）；如果發(fā)生了不準(zhǔn)確的NHEJ修復(fù)，會(huì)有一個(gè)或兩個(gè)等位基因被修飾（Indel）；如果發(fā)生了成功的HDR，則可以獲得一個(gè)或兩個(gè)等位基因中引入了目標(biāo)SNP的細(xì)胞（Successful HDR）。 |
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| 圖三 |
| 如圖三：演示了如何鑒定是否發(fā)生了G>A單堿基替換，以及是否為含有兩個(gè)不同等位基因的雜合克隆，其中G是野生型堿基，被編輯為A。在基因編輯后，將單細(xì)胞擴(kuò)培成為克隆細(xì)胞系，目標(biāo)基因的靶標(biāo)位點(diǎn)可能具有幾種不同的基因型結(jié)果。擴(kuò)增靶位點(diǎn)后，將PCR產(chǎn)物與不同的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交：displacement oligo（紫色）與flap-probe oligo A（綠色；編碼SNP等位基因，A）或flap-probe oligo B（紅色；編碼WT等位基因，G）組合使用。寡核苷酸退火至PCR產(chǎn)物后，Guide-it Flapase酶（剪刀所示）識(shí)別完全的堿基配對(duì)，并切割flap-probe oligo 5’端部分。切割下來(lái)的flaps由相對(duì)應(yīng)的Guide-it flap detectors檢測(cè)，并分別產(chǎn)生綠色或紅色熒光信號(hào)。在圖三的示例中，在靶標(biāo)位點(diǎn)僅產(chǎn)生紅色信號(hào)的克隆細(xì)胞系分析是純合WT（G/G），而同時(shí)產(chǎn)生紅色和綠色信號(hào)的則是攜帶已編輯和WT等位基因（G/A）的雜合克隆。 |
接下來(lái)我們一起來(lái)看下用戶(hù)反饋吧！ |
| “The kit was very good at identifying WT/SNV hets, which is often what I'm looking to uncover.” —Dr. Justin McDonough, THE JACKSON LABORATORY |
| “The assay was easy and fairly quick to perform...Sanger sequencing was complicated to analyze since one allele was edited and the other allele had an indel resulting in mixed electropherograms...I like the fact that the fluorescent probes are built into the kit and the user only needs to supply fairly standard probes which are not very expensive." —Dr. Karin Nitiss, UNIVERSITY OF ILLINOIS AT CHICAGO |
頁(yè)面更新：2023-07-17 12:54:13
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