| Takara逆轉(zhuǎn)錄病毒基因?qū)胂到y(tǒng)解決方案 | ||||||||
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒，能夠?qū)⒒驅(qū)胫炼鄶?shù)處于增殖期的細(xì)胞中，由于導(dǎo)入基因可整合到染色體中，因此可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒制備相對(duì)容易，但仍然需要在P2級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下操作。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基于莫羅尼小鼠白血病病毒（MoMLV）開(kāi)發(fā)的，在基因治療方面有著豐富的應(yīng)用實(shí)績(jī)，也已被廣泛應(yīng)用于腫瘤和干細(xì)胞研究。 |
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| 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 |
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| 野生型莫羅尼小鼠白血病病毒（MMLV）基因組約8.2 kb（包括兩個(gè)LTR）。人工構(gòu)建一個(gè)大于8.2 kb的基因組，同樣也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生不穩(wěn)定的病毒粒子和病毒滴度的下降。與慢病毒表達(dá)載體相類似，大部分病毒基因組已被其他有用的序列（如篩選標(biāo)記或熒光蛋白基因）取代，但仍有足夠的空間用于克隆轉(zhuǎn)基因。由于不同逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體包含的有用序列不同，因此用于克隆轉(zhuǎn)基因的可用空間也不同。 | ||||||||
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝制備 |
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| 與慢病毒相似，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒也會(huì)有產(chǎn)生RCL的可能性，所以逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒也會(huì)進(jìn)行特別設(shè)計(jì)。病毒包裝用質(zhì)粒上插入有逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)基因，gag-pol和env基因，這兩種基因是逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建和復(fù)制所必需的基因，但是質(zhì)粒上缺少包裝信號(hào)Ψ序列和LTR序列，因此包裝用質(zhì)粒本身是無(wú)法包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒的，只有將其和包含Ψ序列和LTR序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到293或者293T包裝細(xì)胞中，才能包裝得到逆轉(zhuǎn)錄病毒，產(chǎn)生具有自我復(fù)制能力逆轉(zhuǎn)錄病毒的幾率也非常低。 為方便使用，可以構(gòu)建gag和pol基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。這樣將含有env基因的表達(dá)質(zhì)粒和克隆了目標(biāo)基因的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，就可以制備出重組逆轉(zhuǎn)錄病毒了。這樣的包裝細(xì)胞系，有助于降低轉(zhuǎn)染難度，提高成功率。 |
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| 逆轉(zhuǎn)錄病毒一般實(shí)驗(yàn)流程 |
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| 以Takara穩(wěn)定表達(dá)gag和pol基因的GP2-293包裝細(xì)胞為例 | ||||||||
| Takara Retro-X™ 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因?qū)胂到y(tǒng)可以提供從載體、包裝系統(tǒng)到病毒滴度測(cè)定、病毒濃縮和整合位點(diǎn)分析試劑盒一整套逆轉(zhuǎn)錄病毒基因?qū)氘a(chǎn)品。 |
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| 這款通用型包裝系統(tǒng)是非常優(yōu)質(zhì)的一款逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)，病毒包裝使用GP2-293包裝細(xì)胞系。常用的四種包膜，包括VSV-G、eco、ampho和10A1，分別由四種不同的載體單獨(dú)提供，可以根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞選擇最適合的包膜。包膜載體與逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)可以獲得高滴度的兼嗜性、單嗜性、雙嗜性或泛嗜性病毒粒子。 | ||||||||
| 下圖為使用表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和相對(duì)應(yīng)的一種包膜載體共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞，四種包膜載體均由Retro-X通用型包裝系統(tǒng)(圖A-D)提供。轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞48小時(shí)后，取10 μl病毒液感染NIH 3T3細(xì)胞。48小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒滴度。藍(lán)色區(qū)域表示陽(yáng)性細(xì)胞，紫色線表示陰性對(duì)照細(xì)胞。不同包膜類型都可以獲得理想的病毒滴度。 | ||||||||
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| Retro-X qRT-PCR Titration Kit提供了一種快速簡(jiǎn)便的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定方法。這款試劑盒使用qRT-PCR和TB Green技術(shù)，在對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組拷貝數(shù)定量之前使用了RNA快速純化步驟。這個(gè)方法中引入的RNA純化和DNase I處理過(guò)程對(duì)該方案是至關(guān)重要的，因此即使是使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝的病毒（總是含有殘留的質(zhì)粒DNA），也可以使用該試劑盒準(zhǔn)確定量 。這種滴度檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間只需要4小時(shí)，并且適用于所有基于MMLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(不包括MSCV)。相較于需要長(zhǎng)達(dá)10天才能完成的傳統(tǒng)滴度測(cè)定方法，大大縮短了病毒收獲和目標(biāo)細(xì)胞感染之間的時(shí)間間隔。 |
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| 經(jīng)驗(yàn)證這款試劑盒具有廣泛的動(dòng)態(tài)范圍。使用這款試劑盒對(duì)109-104個(gè)拷貝的Retro-X RNA對(duì)照模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，從擴(kuò)增結(jié)果圖來(lái)看，在無(wú)模板空白對(duì)照(NTC)低背景情況下，顯示了至少6個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍(圖A)。圖A的滴定標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示Ct和RNA拷貝數(shù)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）之間存在很強(qiáng)的線性相關(guān)性，R2=1.000，PCR效率為107.4%(圖B)。 |
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| Retro-X Concentrator是一款可以快速、簡(jiǎn)單和高效地濃縮任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃縮試劑，基于MMLV或MSCV的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液均適用。這款濃縮試劑使用簡(jiǎn)便，只需將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液與濃縮試劑按照建議比例混合，孵育一段時(shí)間后，使用標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)對(duì)混合物進(jìn)行離心和收集。使用這款濃縮試劑，不需要超速離心操作，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度提升至高100倍， 并獲得非常好的回收率。 | ||||||||
| 這種病毒濃縮方法遠(yuǎn)比超速離心法要簡(jiǎn)單的多。與超速離心法相比較，這款濃縮試劑使用起來(lái)要比超速離心更靈活、更易于使用。Retro-X Concentrator是一種4X濃縮液，因此它可以對(duì)任何體積的含有任何病毒量或任何起始滴度的病毒上清液進(jìn)行濃縮。 | ||||||||
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| Retro-X Integration Site Analysis Kit是一款整合位點(diǎn)分析試劑盒，可以鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在宿主細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制生命周期，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組的DNA拷貝會(huì)隨機(jī)整合到宿主基因組中。所選擇的整合位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和宿主細(xì)胞的表型都會(huì)有重要影響。這款試劑盒使用GenomeWalker技術(shù)來(lái)識(shí)別整合位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，可以獲知相對(duì)應(yīng)的染色體整合位點(diǎn)。 | ||||||||
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| Takara的受體增強(qiáng)技術(shù)可用于臨時(shí)提高任何想要感染的靶細(xì)胞表面的病毒受體蛋白密度，讓原本由于受體密度低而對(duì)病毒感染具有抵抗力的細(xì)胞變得能夠被有效感染。Ecotropic Receptor Booster可以讓原本只能感染嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的單嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，能夠有效感染人類細(xì)胞。如下圖所示，單嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒通常不能有效感染Jurkat細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞或人原代神經(jīng)祖細(xì)胞。然而，使用Ecotropic Receptor Booster預(yù)處理這些類型的細(xì)胞后，這些細(xì)胞就能被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。 | ||||||||
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除此以外，還可以提供豐富多樣的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體套裝，包括組成型表達(dá)載體，專為高病毒滴度和高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平而設(shè)計(jì)；四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)載體（Tet-One系統(tǒng)），實(shí)現(xiàn)盡可能嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜刂苹虮磉_(dá)；MSCV表達(dá)載體，可以在多能細(xì)胞系中包括小鼠或人類造血細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES)和胚胎癌(EC)細(xì)胞，導(dǎo)入和表達(dá)靶基因；以及帶有熒光蛋白基因的載體，可以用作亞細(xì)胞定位或標(biāo)簽研究，或者報(bào)告基因相關(guān)研究。 |
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以為這就是全部嗎？當(dāng)然不是，點(diǎn)擊鏈接了解更多>>重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)制品。 |
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| Takara Bio作為重要的生物技術(shù)企業(yè)，在病毒基因?qū)胂到y(tǒng)方面造詣?lì)H深、體系完備，擁有慢病毒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒系統(tǒng)、腺病毒全套解決方案，為相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供強(qiáng)力支持，為寄予厚望的細(xì)胞與基因治療研究護(hù)航加碼。 |
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頁(yè)面更新：2024-01-31 09:17:40
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