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qPCR實驗結(jié)果孬？Takara幫你補補腦

一、首先要注意防污染，實驗室如果是進行病毒病原菌的檢測的話，防污染更是重中之重的一個事項，在整個的操作過程中都要避免產(chǎn)生各類污染。

① 實驗室應(yīng)盡量進行嚴(yán)格的分區(qū)，包括RNA提取的區(qū)域，反應(yīng)液配置區(qū)，模板添加區(qū)。那么在反應(yīng)液配置區(qū)，一定不要有核酸的出現(xiàn)，RNA的提取和模板添加的操作最好在生物安全柜中進行。相應(yīng)的設(shè)備、器具、試劑和耗材等都要分區(qū)來使用。
② 在進行加樣的時候，槍頭盒必須要保持關(guān)閉的狀態(tài)，也不可以在吸完陽性對照之后經(jīng)過打開的槍頭盒上方，這些都是可能會引起污染的。
③ 在加樣順序方面，應(yīng)在反應(yīng)液配置區(qū)添加陰性對照并蓋好蓋子后，再拿到模板添加區(qū)加入待檢核酸，最后再加陽性對照。
防污染為什么如此重要呢，因為qPCR是一種靈敏度非常高的實驗技術(shù)，一旦有污染出現(xiàn)之后進行去除是非常困難非常麻煩的，所以一定要注意防污染操作。

二、在試劑的使用方面需要注意，我們使用的試劑大部分都是預(yù)混型的，為了保護試劑中的酶通常還會加入甘油等粘度較大的物質(zhì)，試劑使用前一定要在冰上完全融化并且混勻后再使用，有的老師因為沒有將試劑混勻而導(dǎo)致實驗結(jié)果不佳，白白浪費了很多時間。

【在2023年Takara推出了多款全新的qPCR相關(guān)試劑：染料法qPCR試劑——CN830、定量專用反轉(zhuǎn)錄試劑——RR092和探針法qPCR試劑——RR393都是預(yù)混型的試劑，一定要完全混勻之后再進行使用】
劃重點，混勻方法各有不同，要注意啊！
混勻時要注意輕柔的混勻，不要使用振蕩器，因為試劑中含有酶，使用振蕩器劇烈混勻的話可能會導(dǎo)致酶活下降。
如果是體積比較小，不超過100 μl的組分，用手輕彈管底就可以了，對于體積大一些的組分，可以采用邊顛倒邊輕彈的方式混勻。下面我們來通過視頻來看一下具體如何操作。

①首先是體積不超過100 μl的組分，可以用手輕彈管底，使液面上下浮動，要盡量避免起泡，再使用桌面小離心機進行瞬時離心。

②體積較多的超過100μl的組分，采用邊顛倒邊輕彈的方式混勻，也要注意盡量避免產(chǎn)生氣泡，顛倒10次左右，再使用桌面小離心機瞬時離心。

③在進行模板稀釋的時候也應(yīng)該采用輕彈離心的方式進行混勻。

【進行模板稀釋的時候推薦使用Takara的EASY Dilution II（Code No. 9451），如果用滅菌水或TE Buffer稀釋模板DNA或RNA，由于受離心管的吸附作用等原因的影響，往往不能準(zhǔn)確地進行稀釋，導(dǎo)致實驗結(jié)果準(zhǔn)確度下降?！?/td>

三、最后一個需要注意的方面呢，是要在實驗操作中保持良好的操作習(xí)慣，這樣可以減少平行樣之間的操作誤差。

①可以通過先配置預(yù)混液分裝再加入模板的方式減少誤差。配置預(yù)混液時需要先加入體積最大且最穩(wěn)定的組分——通常是水，而體積最小且最不穩(wěn)定的組分需要最后加入——常常是酶，預(yù)混液也要記得進行顛倒混勻或者使用移液器吸打混勻之后再進行分裝。
②一些試劑或者模板/引物的加入量很少，移液器是否準(zhǔn)確也是一個關(guān)鍵問題，一個很小的誤差經(jīng)過指數(shù)放大之后就會變得明顯，對Ct值的影響還是非常大的，而且平行樣之間如果差距比較大，和移液器是否正確使用、有沒有定期校正都是有關(guān)系的。

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☆ 定量PCR專用稀釋液

注：9451與9160在性能上沒有明顯區(qū)別，但9451可以與更多的PCR試劑和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑一起使用，然而我們并沒有確認(rèn)其與所有試劑的兼容性，請以實際實驗結(jié)果為準(zhǔn)。

實驗例

分別使用 EASY Dilution II（for Real Time PCR）（Code No. 9451）和 TE Buffer（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）對模板（轉(zhuǎn)錄的RNA，Lambda imm434 bacteriophage）進行稀釋，并以它們?yōu)槟０迨褂肨B Green^® Premix Ex Taq^™ II (Tli RNaseH Plus)（RR820）進行實時定量PCR反應(yīng)。比較結(jié)果如下：