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qPCR技術(shù)介紹（四）——數(shù)據(jù)解析篇

定量的基本原理

qPCR通過(guò)熒光信號(hào)值實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，在指數(shù)擴(kuò)增期進(jìn)行定量分析。
PCR每進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，DNA呈2倍的指數(shù)關(guān)系增長(zhǎng)，不久達(dá)到平臺(tái)期。
假設(shè)起始DNA的量為A₀，經(jīng)過(guò)了n個(gè)循環(huán)后，理論上DNA產(chǎn)物的量可以表示為：
A_n=A₀×2ⁿ
那么，起始DNA量A₀越多，擴(kuò)增產(chǎn)物的量便越早達(dá)到檢出值A(chǔ)_n，達(dá)到A_n時(shí)的循環(huán)圈數(shù)即Ct值。也就是起始DNA量A₀越多，擴(kuò)增曲線越早起峰，對(duì)應(yīng)需要的循環(huán)圈數(shù)n越小。

理論上，Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系。

我們將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，作為模板進(jìn)行Real Time PCR，就會(huì)按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。根據(jù)Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，就可以制作出【標(biāo)準(zhǔn)曲線】。
未知濃度的樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模板量，這就是qPCR的定量原理。

標(biāo)準(zhǔn)曲線

進(jìn)行絕對(duì)定量，需要使用濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
對(duì)qPCR引物進(jìn)行性能驗(yàn)證時(shí)，也需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)判斷。
下面就是如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品，如何制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及如何評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的介紹。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備

標(biāo)準(zhǔn)品要滿足以下條件：
1. 濃度或拷貝數(shù)是已知的。
2. 與實(shí)際檢測(cè)樣品間的擴(kuò)增效率一致。

如果待檢測(cè)的模板是基因組DNA，就要選擇基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。但很難獲得目的基因濃度是已知的基因組DNA時(shí)，或者目的基因的豐度較低時(shí)，對(duì)于DNA起始的材料必須構(gòu)建質(zhì)粒。
所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，不僅要具有目的序列，還要在目的序列的兩側(cè)各多加一段序列，使其更加接近實(shí)際檢測(cè)樣品的結(jié)構(gòu)，以保持與實(shí)際檢測(cè)樣品間的擴(kuò)增效率的一致性。

進(jìn)行mRNA表達(dá)解析時(shí)，最好選擇表達(dá)目的基因的Total RNA或以Total RNA為模板合成的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。但很難獲得目的基因濃度是已知的的Total RNA時(shí)，必須構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄RNA。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)備5～6個(gè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品

將這些標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)

得到各濃度下的Ct值

通過(guò)Ct值與起始模板濃度的對(duì)數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不需要人工操作，由儀器自動(dòng)完成。

理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個(gè)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)（r²）和斜率（slope）。
相關(guān)系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想值應(yīng)大于0.98，越接近于1說(shuō)明直線性越好，定量越準(zhǔn)確。

斜率反映PCR擴(kuò)增效率（E），PCR理想的擴(kuò)增效率應(yīng)在0.9<E<1.1范圍, 如果PCR擴(kuò)增效率低時(shí)必須重新設(shè)計(jì)引物; 如果PCR擴(kuò)增效率比理論值高時(shí)，說(shuō)明反應(yīng)體系中有可能存在對(duì)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PCR反應(yīng)的阻害物質(zhì)，需要改進(jìn)提取方法。

融解曲線

采用TB Green熒光嵌合法檢測(cè)時(shí)，可以通過(guò)融解曲線分析，確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性。

融解曲線分析的原理

PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)液的溫度漸漸升高，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)TB Green的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化。

起初，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈雙鏈，具有較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度

隨著溫度的漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開(kāi)，嵌入DNA雙鏈中的TB Green數(shù)量減少，熒光信號(hào)強(qiáng)度就漸漸降低

當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，此時(shí)的溫度即融解溫度（Tm值）

左圖為融解曲線的一次曲線，右圖為融解曲線的負(fù)一次微分曲線，通常使用融解曲線的負(fù)一次微分曲線進(jìn)行分析的較多。

Tm值與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列有關(guān)，對(duì)于某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。

理想的融解曲線應(yīng)該是只有單一峰型的曲線，如果出現(xiàn)兩個(gè)以上的峰型，說(shuō)明有引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化或重新設(shè)計(jì)引物。

頁(yè)面更新：2023-03-30 16:30:45

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