| qPCR技術(shù)介紹（一）——基礎(chǔ)概念 | |||||||||
| Real Time PCR，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也被稱為定量PCR或qPCR，是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法。 由于定量PCR具有操作簡(jiǎn)單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、藥物療效考核、基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測(cè)、病原體檢測(cè)、動(dòng)植物檢測(cè)、食品檢測(cè)等各種領(lǐng)域。 所以，無論您從事生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究，還是制藥企業(yè)、畜牧養(yǎng)殖企業(yè)、食品企業(yè)的從業(yè)人員，乃至出入境檢驗(yàn)檢疫局、環(huán)境監(jiān)測(cè)部門、醫(yī)院等單位的員工，都會(huì)或多或少地接觸到或者需要了解掌握定量PCR的知識(shí)。 |
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| Real Time PCR，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過定量PCR儀器，對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最終對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。 | |||||||||
| 【擴(kuò)增曲線】即描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線。PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。 | |||||||||
| 【擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期】隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭、反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸對(duì)合成反應(yīng)的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指數(shù)擴(kuò)增，而最終將進(jìn)入平臺(tái)期。 | |||||||||
| 【擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)】盡管平臺(tái)期的變化很大，但在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)的某一區(qū)域，重復(fù)性非常好，這對(duì)PCR的定量分析非常重要。 | |||||||||
| 【閾值和Ct值】我們?cè)跀U(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)適當(dāng)位置設(shè)定熒光檢出界限值，即閾值（Threshold）。閾值與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)就是Ct值，也就是Ct值是指達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)圈數(shù)（Threshold Cycle）。 | |||||||||
| 下圖清晰地顯示了閾值線與擴(kuò)增曲線、閾值與Ct值之間的關(guān)系。 | |||||||||
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| 經(jīng)數(shù)學(xué)理論證明，Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系。Real Time PCR實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在指數(shù)擴(kuò)增期進(jìn)行定量。PCR每進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，DNA呈2倍的指數(shù)關(guān)系增長(zhǎng)，不久達(dá)到平臺(tái)期。 | |||||||||
| 假設(shè)起始DNA的量為A0，經(jīng)過了n個(gè)循環(huán)后，理論上DNA產(chǎn)物的量可以表示為： | |||||||||
An=A0×2n |
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| 那么，起始DNA量A0越多，擴(kuò)增產(chǎn)物的量便越早達(dá)到檢出值A(chǔ)n，達(dá)到An時(shí)的循環(huán)圈數(shù)即Ct值。也就是起始DNA量A0越多，擴(kuò)增曲線越早起峰，對(duì)應(yīng)需要的循環(huán)圈數(shù)n越小。 | |||||||||
| 我們將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，作為模板進(jìn)行Real Time PCR，就會(huì)按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。根據(jù)Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系，就可以制作出【標(biāo)準(zhǔn)曲線】。 | |||||||||
| 未知濃度的樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模板量，這就是Real Time PCR的定量原理。 | |||||||||
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| Real Time PCR是通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度來檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的，其熒光檢出方法可分為熒光染料嵌合法和熒光探針法兩大種類。 | |||||||||
| 熒光染料，如TB Green®，可以與PCR體系中的雙鏈DNA非特異性結(jié)合，結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光。 隨著PCR循環(huán)圈數(shù)的增加，反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度呈指數(shù)增加。通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中的DNA擴(kuò)增量，進(jìn)而反推算樣本中的起始模板量。 |
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| 熒光探針，如TB Green®是5'端帶有熒光基團(tuán)，3'端帶有淬滅基團(tuán)的一段核酸序列，可以與模板特異性結(jié)合。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)淬滅，不能發(fā)出熒光。而當(dāng)探針被分解后，熒光物質(zhì)會(huì)游離出來，發(fā)出熒光。 | |||||||||
| PCR反應(yīng)液中加入了熒光探針，在退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板的特異位置結(jié)合。延伸過程中，PCR酶的5'→3'外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，熒光物質(zhì)游離處理，發(fā)出熒光。通過檢測(cè)反應(yīng)體系中探針的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。 | |||||||||
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| 如果用于區(qū)別同源性高的序列，以及進(jìn)行SNP分型解析等多重PCR檢測(cè)，熒光探針法無可替代。 而進(jìn)行除此之外的Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，可以使用簡(jiǎn)單易行、成本低的熒光嵌合法。 |
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頁面更新：2023-03-30 16:31:34
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