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PCR, LA PCR™ & Hot Start PCR的說明
■ PCR 法的原理
PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一種體外擴增DNA的方法。通過以下三個步驟：
       DNA鏈的熱變性 (Denaturation step)
       引物退火 (Annealing step)
       聚合酶作用下引物的延伸 (Extension step)
循環(huán)往復，可在短時間內擴增DNA達105倍以上。TaKaRa Taq 是一種94 kDa的高純度耐熱性DNA聚合酶，是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大腸桿菌中表達后，分離提取得到的，與野生型DNA polymerase具有相同的功能。
 
圖1 PCR法的原理圖
Step 1：在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反應液中雙鏈DNA熱變性 (94℃、30 sec)
Step 2：引物與熱變性生成的單鏈DNA退火 (55℃、30 sec)
Step 3：在DNA聚合酶作用下合成互補鏈 (72℃、1 min)
Step 4：擴增的雙鏈DNA再次熱變性生成單鏈DNA (返回Step 1)
Step1～4稱為一個循環(huán)，如此循環(huán)往復25～30次。
注：不同的DNA片段要達到最高的擴增效率，需要設定不同的反應條件。
 
■ LA PCR™
PCR法不僅僅局限于分子生物學，還因其簡便、迅速等特點被廣泛應用于醫(yī)學、法醫(yī)學、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗、動植物檢驗等其它領域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。
1. 可信度 (Fidelity)
通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應有時會出現(xiàn)錯配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克隆、變異導入等實驗中，需加以注意。
2. 擴增的DNA長度
使用Taq DNA Polymerase進行PCR擴增時，通常可擴增幾kb的DNA，超過10 kb則比較困難。這就給利用PCR進行Mapping等Genome解析帶來麻煩。
3. 擴增量
使用Taq DNA Polymerase進行PCR產物克隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗等時，擴增量常常達不到要求。
為解決以上難題，Takara在對Polymerase、Buffer及反應條件等進行深入研究的基礎上，開發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術，運用此技術可大量正確地擴增長達40 kb 的DNA片段。LA PCR技術擴展了PCR的應用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長片段 DNA的克隆及變異導入等方面發(fā)揮優(yōu)勢。
 
■ LA PCR的原理
LA PCR的關鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當有錯誤的堿基攝入時，反應性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯配的堿基除去，從而延伸反應能順利地進行下去，使長鏈DNA的擴增成為可能。
 
圖2 LA PCR的原理圖
 
■ Hot Start PCR的原理
Hot Start PCR法是提高PCR特異性的重要方法之一。這種方法可以防止在PCR反應第一步驟因引物的錯配或引物二聚體的形成而導致的非特異性擴增，從而可以提高目的DNA片段的擴增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version，TaKaRa Ex Taq Hot Start Version，TaKaRa LA Taq Hot Start Version，PrimeSTAR HS DNA polymerase，MightyAmp DNA Polymerase是抗體和DNA聚合酶的混合制品?？贵w在高溫加熱前與聚合酶相結合，抑制聚合酶的活性。在PCR反應最初的DNA變性步驟，抗體變性，聚合酶活性恢復。
 
圖3 Hot Start PCR的原理圖
 

頁面更新：2017-04-06 16:32:13