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產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

合成常見問答
Q-1: 怎樣對(duì)合成DNA/RNA制品進(jìn)行定量?
A-1:
由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，因此常根據(jù)此性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸溶液在260 nm的吸光度值，據(jù)此對(duì)核酸進(jìn)行定量，用OD值來表示。1 OD是指：置于光路長度為1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液，如果其在260 nm處的吸光度值為1，則稱1 ml該溶液中溶解的DNA/RNA的量為1 OD。1個(gè)OD值的合成DNA/RNA的質(zhì)量約為33 μg。
 
Q-2: 如何測(cè)定并計(jì)算OD值?
A-2:
將DNA/RNA溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使吸光度測(cè)定值與樣品濃度的關(guān)系在直線范圍內(nèi)，再根據(jù)原溶液的總體積與稀釋倍數(shù)計(jì)算該溶液的總OD值。例如，一個(gè)200 μl的DNA/RNA溶液，如果對(duì)其進(jìn)行6倍稀釋，測(cè)定值為1.0時(shí)，則該溶液的總OD值為：0.2 ml×6×1.0 OD/ml=1.2 OD 。
 
Q-3: 合成的DNA應(yīng)如何保存?
A-3:
1. 干燥制品很穩(wěn)定，-20℃下保存2年沒問題。
2. 溶解后的DNA也請(qǐng)保存于-20℃，最好是分份保存，避免反復(fù)凍融。
 
Q-4: 合成DNA溶液在室溫下放置了數(shù)天，還可以使用嗎?
A-4:
溶液中的Oligo DNA在常溫下放置3～4天應(yīng)該沒問題，但最好不要放置一個(gè)星期以上。其壽命與容器、溶劑的滅菌程度有關(guān)。
 
Q-5: 合成的RNA應(yīng)如何保存?
A-5:
1. 干燥制品如能存放于-80℃是最理想的，如不能請(qǐng)于-20℃保存，保存2年沒問題。
2. 溶液狀態(tài)的RNA最好保存在-80℃，如無條件，請(qǐng)保存于-20℃。
 
Q-6: 合成的熒光標(biāo)記探針應(yīng)如何保存?
A-6:
1. 熒光探針必須避光保存。
2. 本公司做過幾條探針的保存穩(wěn)定性試驗(yàn)，干燥品-20℃保存2年未發(fā)現(xiàn)降解。作為本公司試劑盒中的組分，-20℃保存2年，探針功能正常。
 
Q-7: 制品溶解后發(fā)現(xiàn)有少許沉淀，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎?
A-7:
所有的制品純化后都要進(jìn)行脫鹽，脫鹽是使用C18柱進(jìn)行的，偶而會(huì)有微量的樹脂溢出而進(jìn)入制品。樹脂不影響任何反應(yīng)結(jié)果，請(qǐng)稍許離心后取上清使用。
 
Q-8: 測(cè)定了制品的OD值后發(fā)現(xiàn)OD260/OD280<1.8，制品質(zhì)量 (純度) 合格嗎?
A-8:
由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280 nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時(shí)，常用OD260/OD280比值來評(píng)價(jià)核酸純度 (比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個(gè)堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì)大大低于1.8。此外，序列中堿基的排列順序也影響該比值。所以不能根據(jù)OD260/OD280比值來評(píng)價(jià)合成DNA/RNA制品的純度。
堿基組成 A260/A280
100%A
100%G
100%C
100%T
A、G、C、T（各25%）		 2.50
1.85
1.15
1.14
1.66
 
Q-9: 能否根據(jù)電泳帶的亮度對(duì)合成的DNA/RNA制品進(jìn)行定量?
A-9:
不能。因?yàn)镋tBr是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA/RNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EtBr染色。由于不同制品的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EtBr染色帶的亮度來對(duì)合成的DNA/RNA進(jìn)行定量。
 
Q-10: 使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA制品，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?
A-10:
Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶 (更無法用Agarose電泳進(jìn)行定量了)。
 
Q-11: 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?
A-11:
1. A、G、C、T的組成不同，電泳速度不同；
2. DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。
 
Q-12: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，為什么?
A-12:
如果測(cè)序后引物處出現(xiàn)了問題，不排除PCR錯(cuò)配的可能，但更主要的原因應(yīng)在合成引物本身。在引物合成過程中，除了人為將序列輸錯(cuò) (可核對(duì)合成報(bào)告單)，化學(xué)合成方法本身不可避免地會(huì)產(chǎn)生失敗序列，具體分析如下：
1. 由于DNA合成是從3′ →5′ 端一個(gè)堿基一個(gè)堿基地連接上去的，每連接上一個(gè)堿基，都需要多步化學(xué)反應(yīng) (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱之為一個(gè)循環(huán)。Coupling是上一個(gè)堿基的5′ OH 與下一個(gè)堿基的3′ 活性部分發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達(dá)99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個(gè)堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；
2. Capping是將沒有連接上下一個(gè)堿基的5′ -OH乙?；柚蛊溥M(jìn)一步延伸。Capping的效率不可能達(dá)到100%，沒有被Cap的5′ OH會(huì)進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；
3. Detritylation是將上一個(gè)堿基5′ OH上的保護(hù)基脫掉，準(zhǔn)備連接下一個(gè)新堿基，脫保護(hù)的效率也很難達(dá)到100%，沒有脫保護(hù)的5′OH會(huì)跳過該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；
4. 在Coupling步驟中，新堿基 (活性狀態(tài)) 在沒有與上一個(gè)堿基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)前發(fā)生自身連接，造成多堿基的失敗序列；
5. 合成時(shí)堿基G可能會(huì)轉(zhuǎn)化成烯醇式異構(gòu)體，PCR擴(kuò)增時(shí)被DNA聚合酶識(shí)別作A，發(fā)生 G到A的轉(zhuǎn)換。上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對(duì)40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是PAGE；而對(duì)40 mer以上的DNA制品PAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對(duì)PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，一定要選擇PAGE純化或HPLC純化的引物。
 
Q-13: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，怎么辦?
A-13:
1. 因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?00%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請(qǐng)重新挑選一個(gè)克隆測(cè)序，會(huì)得到正確的結(jié)果。
2. 如果挑選2～3個(gè)克隆測(cè)序情況還沒改觀，我們會(huì)免費(fèi)重新合成引物。
 
Q-14: 進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)個(gè)月不成功，后經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物處有錯(cuò)誤，怎么辦?
A-14:
1. 表達(dá)實(shí)驗(yàn)之前一定要對(duì)DNA序列進(jìn)行驗(yàn)證。
2. 我們可以免費(fèi)重新合成引物。
3. 如進(jìn)行索賠時(shí)，按國際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內(nèi)。
 
Q-15: 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?
A-15:
1. 合成Oligo DNA時(shí)，選用高純度級(jí)制品。
2. 避免使用過長的Oligo DNA，最好選用小于35 mer的合成DNA制品。
3. 進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次克隆都須進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，尤其需要注意。
 
Q-16: Takara可合成多長的DNA，多長的RNA?
A-16:
Takara合成DNA的長度為2～150個(gè)堿基；合成RNA的長度為2～110個(gè)堿基。當(dāng)合成的DNA序列較長時(shí)，由于合成及純化方法的限制,很難保證制品中每個(gè)序列都正確無誤。此外需要說明的是：如果待合成序列比較特殊 (例如多個(gè)“G”連續(xù)出現(xiàn)等)，合成收率相對(duì)較低，我們可能會(huì)根據(jù)具體情況加收費(fèi)用；有時(shí)我們也可能無法合成訂購的序列，此時(shí)本公司保留不接受訂單的權(quán)利。
 
Q-17: 一般的合成Oligo DNA的5' 和3' 末端有磷酸基團(tuán)嗎?
A-17:
沒有，5' 和3' 末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，訂貨時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注明，此時(shí)需收取磷酸化 (PO4修飾) 的費(fèi)用。
 
Q-18: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?
A-18:
由于一般的PCR用引物的5′ 末端都沒有磷酸基團(tuán)，因此，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的5′ 末端也沒有磷酸基團(tuán)。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，無法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，背景會(huì)極高。此時(shí)請(qǐng)對(duì)PCR產(chǎn)物的5′ 端進(jìn)行磷酸化 (PO4修飾) 處理。
 
Q-19: 合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無目的帶，怎么辦?
A-19:
PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。
1. 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大?
2. 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)，或者二條引物之間是否形成高次結(jié)構(gòu)?
3. PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作?
4. PCR儀是否工作正常?
5. PCR反應(yīng)條件是否合適?
如果一切正常，還無法解決問題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物。如果重新合成的引物也無法解決問題時(shí)，請(qǐng)把引物和模板寄送給我們公司，我們可以幫助摸索PCR反應(yīng)條件。
 
Q-20: 進(jìn)行反義核酸實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否要對(duì)DNA鏈全部進(jìn)行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性?
A-20:
DNA經(jīng)S代修飾后比較穩(wěn)定，在細(xì)胞中不會(huì)被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但會(huì)降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結(jié)合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數(shù)個(gè)(通常3個(gè))S代磷酯鍵(Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩(wěn)定性，又能增加反義DNA與靶序列的結(jié)合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動(dòng)物體內(nèi)，為增強(qiáng)穩(wěn)定性，還是將整條鏈S代效果更好。
2' -OMe-RNA也阻抗核酸酶降解，可與S代DNA構(gòu)成嵌合的反義核酸，這樣既能增強(qiáng)反義核酸的穩(wěn)定性，又能增加其與靶序列的親和性 (2' -OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。
此外，5-Me-dC由于能增強(qiáng)DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，有時(shí)也被摻入到S代的反義核酸中。
 
 
Q-21: FITC、6-FAM、5-FAM標(biāo)記之間有何區(qū)別?
A-21:
它們皆是熒光素標(biāo)記 (Fluorescein)，三者結(jié)構(gòu)間的區(qū)別如下：
從結(jié)構(gòu)圖可見，5-FAM與6-FAM互為異構(gòu)體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團(tuán)均為熒光素，通常使用中沒有區(qū)別。
 
Q-22：淬滅基團(tuán)為TAMRA或BHQ系列染料的雙標(biāo)記熒光探針在使用上有什么不同?
A-22:
由淬滅基團(tuán)TAMRA或BHQ系列染料組成的雙標(biāo)記熒光探針常常被用作水解探針（Hydrolysis Probes），用于Real Time PCR實(shí)驗(yàn)。由于這些淬滅染料的光譜學(xué)性質(zhì)不同，作為淬滅基團(tuán)使用時(shí)的特點(diǎn)也不同，現(xiàn)說明如下：
1. TAMRA為熒光染料，在淬滅報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)，自身會(huì)在更高波長處發(fā)射熒光，此發(fā)射熒光會(huì)對(duì)報(bào)告基團(tuán)的檢測(cè)造成影響，探針熒光本底（Background）相對(duì)較高。而BHQ系列為非熒光染料，淬滅報(bào)告基團(tuán)，但自身不發(fā)射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測(cè)靈敏度更高。
2. 淬滅基團(tuán)對(duì)報(bào)告基團(tuán)的淬滅有賴于二者的光譜迭蓋（Overlapping），也即報(bào)告基團(tuán)的熒光光譜應(yīng)與淬滅基團(tuán)的吸收光譜相交搭。對(duì)比TAMRA及BHQ系列染料的吸收光譜，可見TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報(bào)告基團(tuán)種類比較少；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報(bào)告基團(tuán)種類更多（像Cyanine 3、Cyanine 5等的淬滅效果都很好）。因此可由BHQ系列染料組成一套雙標(biāo)記熒光探針用于多重PCR（Multiplexing PCR）。
 
Q-23: 雙標(biāo)記熒光探針設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循哪些原則?
A-23:
1. 探針應(yīng)位于兩引物之間；
2. 探針中堿基G、C的含量應(yīng)在20%～80%之間；
3. 避免同種堿基成串出現(xiàn)，特別是堿基“G”；
4. 堿基G不要出現(xiàn)在5' 末端；
5. 探針的TM值要比引物的TM值高8～10℃，應(yīng)在68～70℃之間；
6. 探針長度超過30個(gè)堿基時(shí)，最好把淬滅基團(tuán)放在中間，以防止熒光本底過高，這時(shí)探針的3'末端應(yīng)加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應(yīng)過程中延伸。
 
Q-24: 何謂分子信標(biāo) (Molecular Probes)？與普通的雙標(biāo)記探針相比，在使用上有什么特殊性？
A-24:
Molecular Probes是一類特殊的雙標(biāo)記探針，通常狀態(tài)下，其兩末端互補(bǔ)配對(duì)，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu))，發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)迫使分別連在兩末端的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊密鄰近 (此時(shí)檢測(cè)不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，Molecular Probes變得明亮起來，可檢測(cè)到熒光。由于發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，探針對(duì)靶序列檢測(cè)的特異性增強(qiáng)，相對(duì)于普通的雙標(biāo)記探針，Molecular Probes對(duì)SNP有更強(qiáng)的識(shí)別能力，能區(qū)分序列上僅相差一個(gè)堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測(cè)。此外，Molecular Probes也應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi)的mRNA雜交、RNA加工、及轉(zhuǎn)錄過程的時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)研究等。Molecular Probes的作用原理請(qǐng)參見下圖：
 
Q-25: 何謂Scorpion™ probes，該類型探針在應(yīng)用上有什么特點(diǎn)？
A-25:
Scorpions™ probes是具高靈敏度與特異性的雙標(biāo)記熒光探針和引物構(gòu)成的雜合體，主要設(shè)計(jì)應(yīng)用于定量PCR實(shí)驗(yàn)。下面是蝎型探針的作用原理圖：
Scorpions uni-probe的探針部分為單鏈雙標(biāo)記探針，其結(jié)構(gòu)類似于Molecular Probes，兩末端互補(bǔ)配對(duì)，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu))，發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)迫使分別連在兩末端的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊密鄰近，該雙標(biāo)記探針通過一個(gè)Blocker與PCR引物的5'端相連。Blocker阻止PCR引物的延伸；報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的緊密鄰近使探針中的報(bào)告基團(tuán)不發(fā)熒光。
在定量PCR反應(yīng)的起始循環(huán)中，PCR引物在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，合成引物靶序列的互補(bǔ)鏈，當(dāng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)時(shí)，發(fā)卡環(huán)打開，探針分子內(nèi)雜交到新合成的靶序列上，此時(shí)，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，報(bào)告基團(tuán)可發(fā)射熒光，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度的增加與反應(yīng)體系中靶序列的量成正比。
可設(shè)計(jì)成三種形式的Scorpions™ probe，一種是Scorpions uni-probe，采用發(fā)卡環(huán)形式；另一種是Scorpions bi-probe，采用雙螺旋形式，還有一種是FRET形式的Scorpions™ probe。后兩種Scorpions™ probe的作用原理這里不再詳細(xì)介紹。不過，無論采用何種形式的Scorpions™ probe，其熒光信號(hào)的產(chǎn)生都是源于分子內(nèi)雜交。分子內(nèi)雜交反應(yīng)快速有效，優(yōu)先于任何可能與之競爭的副反應(yīng)，因此使用Scorpions™ probe進(jìn)行定量PCR檢測(cè)的最大優(yōu)點(diǎn)在于：可提供更強(qiáng)的熒光信號(hào)，更短的信號(hào)顯示時(shí)間，同時(shí)與傳統(tǒng)的雙標(biāo)記探針相比，具有更強(qiáng)的錯(cuò)配區(qū)分能力。Scorpions™ probe對(duì)SNP及突變檢測(cè)更為理想。
 
Q-26: 如何對(duì)合成的Oligo DNA/RNA制品進(jìn)行準(zhǔn)確定量？
A-26:
核酸定量普遍采用的方法是紫外分光光度法：測(cè)定核酸溶液在260 nm的光吸收，樣品溶液吸收光的量(吸光度)正比于溶液中溶質(zhì)的量。吸光度與溶液中核酸濃度間的轉(zhuǎn)換關(guān)系依據(jù)Lambert-Beer定律：
A=ε260 C L
其中：
A: 吸光度(OD)
ε260 : 溶液中核酸在260 nm的摩爾消光系數(shù)(單位，L/mol.cm)
C: 溶液濃度(單位，mol/L)
L: 光路長度(單位，cm) 應(yīng)用Lambert-Beer定律對(duì)核酸進(jìn)行定量時(shí)，必須保證測(cè)定值在核酸濃度與吸光度值呈直線關(guān)系的范圍內(nèi)，否則計(jì)算結(jié)果與實(shí)際濃度之間會(huì)出現(xiàn)偏差。 普通的分光光度計(jì) (待測(cè)溶液裝在樣品池中)，測(cè)定樣品溶液濃度準(zhǔn)確的直線范圍通常是吸光度值在0.1～1.0之間，如果待測(cè)樣品溶液濃度過大，必須進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以保證測(cè)定值小于1.0。同樣，待測(cè)樣品溶液的濃度也不能太低，如果測(cè)定值小于0.1，測(cè)定準(zhǔn)確度會(huì)降低(測(cè)定值重復(fù)性降低)。
NanoDrop等微體積測(cè)定儀的測(cè)定原理也是紫外分光光度法，因?yàn)槭褂迷擃悆x器所需樣品溶液體積小，也即光路較短(1 mm或更短)，因此吸光度與樣品濃度間呈直線關(guān)系的范圍加大。但對(duì)NanoDrop1000，測(cè)定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的范圍是2～100 ng/μl,這個(gè)準(zhǔn)確測(cè)定范圍對(duì)于單鏈DNA，相當(dāng)于吸光度值在0.06～3之間，對(duì)于雙鏈DNA，相當(dāng)于吸光度值在 0.04～2之間。因?yàn)榈蜐舛葴y(cè)定對(duì)待測(cè)溶液要求會(huì)很高，溶液中不能有任何微小顆粒，否則測(cè)定結(jié)果會(huì)偏高，因此，應(yīng)用NanoDrop 1000對(duì)單鏈DNA進(jìn)行定量時(shí)，要想獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，通常最低吸光度值高于0.2比較好，也即吸光度測(cè)定值在0.2～3之間。
近些年，針對(duì)低濃度的雙鏈DNA定量發(fā)展了熒光定量技術(shù)。因?yàn)楸M管紫外分光光度法是普遍采用的核酸定量法，但此方法也存在一定缺點(diǎn)：紫外吸收測(cè)定沒有選擇性，不能區(qū)分DNA、RNA和蛋白質(zhì)，測(cè)定結(jié)果也容易受其它污染物 (dNTPs、鹽、有機(jī)化合物)的影響，在有前述干擾物存在時(shí)，不能對(duì)核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量；此外，紫外分光光度法定量核酸的靈敏度也不夠高。熒光定量技術(shù)可特異地定量低濃度溶液中的雙鏈DNA，而不受溶液中存在的RNA、蛋白質(zhì)等污染物的影響。例如，利用Invitrogen的Qubit測(cè)定儀，結(jié)合應(yīng)用Quant-iT dsDNA HS assay試劑盒，可對(duì)濃度低至10 pg/μl的雙鏈DNA進(jìn)行定量。對(duì)低濃度核酸溶液定量，Qubit的定量準(zhǔn)確度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NanoDrop 1000。當(dāng)然，Qubit測(cè)定儀也可特異地定量單鏈DNA、RNA或蛋白質(zhì)，不過需要強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)溶液中單鏈DNA定量時(shí)，應(yīng)該選用與雙鏈DNA不同的熒光定量試劑盒。
對(duì)常規(guī)濃度范圍內(nèi) (吸光度測(cè)定值在0.2～1.0之間) 的合成Oligo DNA/RNA定量，Qubit的測(cè)定結(jié)果應(yīng)該與紫外吸收法的測(cè)定結(jié)果一致 (不同儀器之間測(cè)定結(jié)果可能會(huì)存在系統(tǒng)誤差)。
我們提供的合成Oligo DNA/RNA制品有兩種干燥方式：真空干燥或冰凍干燥，無論您收到的是哪種方式干燥的制品，溶解樣品前，都需要將Tube管進(jìn)行短暫離心，使樣品離心至Tube管底部，再進(jìn)行后續(xù)的溶解、稀釋、測(cè)定等操作，這樣既可保證不損失樣品，同時(shí)也可保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 
Q-27：長度小于15 mer 的Oligo DNA/RNA如何溶解？
A-27:
Oligo DNA/RNA長度≤15 mer或序列特殊的情況下，溶解性會(huì)降低（Milli-Q水可能會(huì)不溶），建議使用TE (pH7.5-8.0) 溶解。
 
Q-28：Takara提供的巰基Oligo制品是二硫鍵形式的嗎？
A-28:
由于自身原因，處于游離態(tài)的巰基（SH-R）在運(yùn)輸或者保存過程中會(huì)發(fā)生自發(fā)氧化，生成二倍體，通常需要在使用前進(jìn)行還原。
為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，方便客戶獲得更佳的使用效果，Takara提供氧化形式存在的巰基修飾Oligos，即二硫鍵（S-S），巰基處于被保護(hù)狀態(tài)。使用前需進(jìn)行還原。以5’巰基為例，還原前后的示意圖如下：
通常使用TCEP或者DTT作為還原劑，TCEP本身不帶電荷，且不含巰基，通常無需從Oligo溶液中去除，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
另外，客戶如有需要，Takara可以隨貨提供還原劑TCEP，請(qǐng)?zhí)峤挥唵螘r(shí)備注說明。
 
 
 

頁面更新：2020-04-26 10:35:14