| 常見問答 |
| Q-1: DNA測序樣品用什么溶液溶解比較好? |
| A-1: 溶解DNA 測序樣品時(shí)，用滅菌蒸餾水溶解最好。DNA的測序反應(yīng)也是Taq 酶的聚合反應(yīng)，需要一個(gè)理想的酶反應(yīng)條件。如果DNA用緩沖液溶解后，在進(jìn)行測序反應(yīng)時(shí)，DNA溶液中的緩沖液組份會影響測序反應(yīng)的體系條件，造成Taq 酶的聚合性能下降。 有很多客戶在溶解DNA測序樣品時(shí)使用TE Buffer。的確，TE Buffer能增加DNA樣品保存期間的穩(wěn)定性，并且TE Buffer對DNA測序反應(yīng)的影響也較小，但根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，我們還是推薦使用滅菌蒸餾水來溶解DNA測序樣品。 |
| Q-2: 提供DNA測序樣品時(shí)，要注意哪些問題? |
| A-2: 一定要注意樣品純度和DNA量。如果客戶提供的質(zhì)粒濃度太低不能測序，我們就需要對質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)需收取轉(zhuǎn)化費(fèi)。有些質(zhì)粒提取法提取的DNA質(zhì)量很好，象Takara、Qiagen、Promega的質(zhì)粒制備試劑盒等。 提供的測序樣品為PCR產(chǎn)物時(shí)。PCR產(chǎn)物必須進(jìn)行切膠回收，否則無法得到良好的測序效果。 有關(guān)DNA測序樣品的詳細(xì)情況請嚴(yán)格參照“測序樣品的提供”部分的說明。 |
| Q-3: 測序結(jié)果有很多套峰 (出現(xiàn)很多N)，還照常收費(fèi)，為什么? |
| A-3: DNA模板上出現(xiàn)二處以上的引物結(jié)合位點(diǎn)，或者DNA模板上有嚴(yán)重的重復(fù)序列，以及測序引物不純時(shí), 測序結(jié)果便會出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因由DNA模板本身或者引物 (限非Takara合成的引物) 本身所造成，對這些結(jié)果，公司會根據(jù)具體情況進(jìn)行收費(fèi)(詳細(xì)見"測序結(jié)果說明")。 |
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| Q-4: 為什么用PCR產(chǎn)物測序時(shí)，經(jīng)常會出現(xiàn)套峰現(xiàn)象? |
| A-4: PCR產(chǎn)物測序出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，一般有以下幾種原因： ◇ PCR用模板不純或PCR用引物特異性不好，擴(kuò)增出的產(chǎn)物除了目的片段外，還有與目的片段長度相近的片段，即使用凝膠電泳也無法分離開，這樣的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果是套峰。 ◇ 結(jié)構(gòu)上的原因，造成了PCR產(chǎn)物測序出現(xiàn)套峰的現(xiàn)象。Poly A，Poly T以及原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，都會出現(xiàn)測序結(jié)果套峰的情況，具體請看問答A-5。 ◇ 引物的非特異結(jié)合會造成雜峰干擾正常峰值，通常是引物不適合測序引起的，更換引物一般會解決。 |
| Q-5: 測序結(jié)果不到500 Bases，還照常收費(fèi)了，為什么? |
| A-5: 如在DNA樣品中的DNA序列分布勻稱，沒有復(fù)雜結(jié)構(gòu)時(shí)，正常的測序反應(yīng)能保證達(dá)到500 Bases以上。 但有一些DNA樣品立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造成聚合酶延伸反應(yīng)終止，測序信號突然減弱或消失，或者測序結(jié)果出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因由DNA模板本身所造成。 對這些結(jié)果，公司會根據(jù)具體測序情況，進(jìn)行收費(fèi)(詳細(xì)見測序結(jié)果說明)。出現(xiàn)這些情況的原因分析如下： ◇ G/C rich、G/C Cluster。這種情況一般表現(xiàn)為測序信號突 然減弱或消失。 |
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| ◇ A、T的連續(xù)結(jié)構(gòu)。這種情況一般表現(xiàn)為A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測序結(jié)果出現(xiàn)套峰。根據(jù)文獻(xiàn)記載，原因在于聚合酶進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，由于A或T的連續(xù)，聚合酶難以識別完整的每個(gè)A或T，在某個(gè)A或T的后面便開始進(jìn)行A或T連續(xù)結(jié)構(gòu)以后序列的聚合反應(yīng)(打滑現(xiàn)象)，造成測序結(jié)果紊亂，出現(xiàn)套峰。 一般在多少個(gè)A或T的后面能出現(xiàn)這種情況呢? 現(xiàn)在還沒有這方面的報(bào)道。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，這一情況的出現(xiàn)和A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列的排列情況有著直接的關(guān)系。有時(shí)10多個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面便出現(xiàn)套峰，但有時(shí)60～70個(gè)A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列也一樣可以完整地讀出來。具體情況還有待考證。 一般來說，PCR片段直接測序時(shí)，A或T的連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的序列測序結(jié)果都會出現(xiàn)套峰。原因在于測序時(shí)經(jīng)歷了PCR反應(yīng)及測序反應(yīng) (測序反應(yīng)本身也是PCR反應(yīng)) 二次聚合酶的打滑現(xiàn)象。 |
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| ◇ 原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，測序結(jié)果出現(xiàn)突然信號減弱或消失。從序列上看，DNA堿基排列并無特別異常。估計(jì)是DNA整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從某一位置開始聚合酶的聚合反應(yīng)便無法進(jìn)行。 |
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| Q-6: 為什么在測序結(jié)果上找不到測序引物的序列? |
| A-6: 目前使用的測序方法是在ddNTP上做熒光標(biāo)記，測序儀通過檢測ddNTP上的熒光來讀取序列，因?yàn)橐锉旧硎遣蛔鰺晒鈽?biāo)記的，所測序列是從引物3′ 末端后第一個(gè)堿基開始的，所以在測序結(jié)果上找不到測序引物的序列。如果是PCR產(chǎn)物，要想得到PCR引物的序列，可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙鏈測通或者將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，用載體上的引物 (注意此引物也不能離插入片段太近) 測序?；蚴窃谝褱y得序列上反向設(shè)計(jì)并合成引物測出引物序列。 |
| Q-7: 在測序結(jié)果上，找不到測序用引物后面的序列，為什么? |
| A-7: 由于測序儀自身缺陷，緊接引物之后的測序結(jié)果信號較弱，一般在測序用引物后面幾個(gè)至數(shù)十個(gè) (嚴(yán)重時(shí)40-50個(gè)) 堿基會讀不出來 (或者讀錯)，請引起注意。 |
| Q-8: 怎樣使用Takara提供的測序結(jié)果? |
| A-8: 我們提供的是根據(jù)測序儀的自動分析，并經(jīng)嚴(yán)格確認(rèn)后的測序結(jié)果。但測序儀有時(shí)會發(fā)生誤讀或漏讀現(xiàn)象，而我們的工作人員在檢查時(shí)也沒有發(fā)現(xiàn)，這時(shí)的結(jié)果會出現(xiàn)錯誤。只有原始的測序彩色波形圖才是最正確的，請客戶拿到結(jié)果后，進(jìn)行詳細(xì)確認(rèn)。如有不明白的地方，請立即和我們聯(lián)系，我們會隨時(shí)確認(rèn)并進(jìn)行解決。 |
| Q-9: PCR片段直接測序和PCR片段經(jīng)克隆后測序的結(jié)果有何區(qū)別? |
| A-9: 眾所周知，PCR擴(kuò)增過程中會出現(xiàn)很多錯配現(xiàn)象，但不可能所有的錯配都發(fā)生在同一位置。PCR片段直接測序時(shí)，其結(jié)果是PCR片段眾多分子的混合物的結(jié)果。如果在某一個(gè)點(diǎn)上出現(xiàn)了幾十次錯配現(xiàn)象，但大多數(shù)分子 (或許是幾十萬個(gè)分子) 在這個(gè)點(diǎn)上應(yīng)該還是正確的，在測序時(shí)，錯配現(xiàn)象也就反映不出來了。因此，PCR片段直接測序的結(jié)果反映的是PCR用模板最原始的結(jié)果。而PCR片段經(jīng)克隆后測序是測定了某一個(gè)分子的DNA序列。在幾十個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過程中，很難保證某一個(gè)分子的任何點(diǎn)都不發(fā)生錯配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測序結(jié)果，往往存在著一些錯配的序列，和PCR片段直接測序的結(jié)果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時(shí)使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過程中的錯配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時(shí)，請選用保真性能高的DNA聚合酶。 |
| Q-10: 測序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么? |
| A-10: 原因有很多，如同一種動物，在不同的種族之間，或者不同的個(gè)體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測序， 那還有PCR過程中的錯配因素等等。我們提供的測序結(jié)果是客戶樣品序列的忠實(shí)結(jié)果，不能保證和文獻(xiàn)序列完全一致，請理解。 |
| Q-11: DNA片段很長，一個(gè)反應(yīng)讀不到頭，怎么辦? |
| A-11: 如果DNA片段克隆在載體中，可以用載體上兩端的引物同時(shí)測序，讓其中間交叉互補(bǔ)，便可完全測通。如果這樣還讀不通，可根據(jù)已經(jīng)測出的序列設(shè)計(jì)測序引物作進(jìn)一步測序 (此稱為Primer Walking法)，便可完全測通。 |
| Q-12: 測序完成后，測序樣品和引物將如何處理 (或保存)? |
| A-12: ◇ 客戶需要將測序樣品或引物 (客戶自帶的) 返還時(shí)，測序結(jié)束后，我們會按客戶要求寄回樣品或引物 (客戶自帶的)。 ◇ 對于沒返回的測序樣品和引物，公司負(fù)責(zé)保存三個(gè)月(從樣品收到之日算起)，超過三個(gè)月還需測序的樣品，請客戶另行提供。 |
| Q-13: 對于測序結(jié)果有疑問怎么辦? |
| A-13: 請客戶仔細(xì)閱讀“測序結(jié)果說明”和“問答”的內(nèi)容，如果還有疑問，請您在收到測序結(jié)果一個(gè)月之內(nèi)與我們聯(lián)系，我們會及時(shí)、認(rèn)真給您檢查測序結(jié)果，分析原因。 |
| Q-14: 怎樣選擇 (設(shè)計(jì)) 測序用引物? |
| A-14: 測序用引物要求非常嚴(yán)格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結(jié)合，3′ 端的幾個(gè)堿基能完全配對，即使引物長達(dá)80～100多個(gè)堿基，只要調(diào)整PCR反應(yīng)條件，也能成功進(jìn)行PCR反應(yīng)。 而測序用引物便不一樣了，必須嚴(yán)格符合以下要求。本公司的測序用引物全用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo設(shè)計(jì)。在本公司測序時(shí)，我們可免費(fèi)幫助設(shè)計(jì)測序用引物。 ◇ 長度在15～25個(gè)堿基左右，一般選擇20個(gè)堿基(根據(jù)GC 含量作適當(dāng)調(diào)整)，3′ 端盡量選擇G或C堿基 (但不絕對)，以增加與模板的結(jié)合能力。 ◇ Tm溫度應(yīng)選擇50℃-70℃左右(根據(jù)所用設(shè)計(jì)引物的軟件不同，溫度選擇范圍不同)。 ◇ GC含量應(yīng)選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu)。 ◇ 避開引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。 ◇ 保證引物和模板100%匹配，特別是3′ 端的幾個(gè)堿基一定 要100%匹配。同時(shí)必須嚴(yán)格保證引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。 |
| Q-15: 怎樣填寫Takara DNA測序服務(wù)登記卡? |
| A-15: ◇ 如果您需要進(jìn)行此項(xiàng)服務(wù)，請?zhí)顚憽?strong>Takara DNA測序服務(wù)登記卡”。填寫后通過傳真或E-mail發(fā)送給我們或當(dāng)?shù)卮砩獭?br /> ◇ 仔細(xì)閱讀“測序樣品的提供”部分，具體填寫測序樣品的詳細(xì)信息。填寫示例參考如下。 |
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頁面更新：2017-04-14 09:43:03
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