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當(dāng)前位置：首頁(yè)> 產(chǎn)品選擇指南 > 限制酶 > 限制酶基本信息 > pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的限制酶雙酶切效果
pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的限制酶雙酶切效果
在基因工程實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常要對(duì)DNA片段進(jìn)行2種限制酶的酶切反應(yīng)。但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)在DNA片段上相鄰或相近的兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)時(shí)，往往達(dá)不到預(yù)期的效果。例如，對(duì)pUC18載體多克隆位點(diǎn)處的Kpn I 和Sma I 進(jìn)行雙酶切時(shí)，酶切反應(yīng)難以進(jìn)行。而針對(duì)有些酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切時(shí)，酶切效果與酶切反應(yīng)所用限制酶的順序還有關(guān)系。例如，要對(duì)Sac I 和Kpn I 這兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切時(shí)，如果先用Sac I 進(jìn)行酶切，然后再用Kpn I 進(jìn)行酶切，雙酶切反應(yīng)則無(wú)法進(jìn)行。但是如果先用Kpn I 進(jìn)行酶切，然后再用Sac I 進(jìn)行酶切，雙酶切反應(yīng)則可以進(jìn)行。造成這些結(jié)果的原因是因?yàn)檫M(jìn)行限制酶的雙酶切反應(yīng)時(shí)，由于受到酶切位點(diǎn)周?chē)鷫A基數(shù)量的影響，從而影響了酶切效果。
本公司對(duì)pUC18/19/118/119載體多克隆位點(diǎn)處的限制酶進(jìn)行雙酶切時(shí)的效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。表1是用兩種限制酶進(jìn)行分步酶切時(shí)的結(jié)果，表2是用兩種限制酶進(jìn)行同步酶切時(shí)的結(jié)果。
為了保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，對(duì)載體多克隆位點(diǎn)上的限制酶進(jìn)行雙酶切時(shí)，應(yīng)該考慮各限制酶之間的位置關(guān)系。建議按照酶切效率高的酶切順序進(jìn)行酶切。
下表中記號(hào)：“O”表示限制酶酶切效果較好；“△”表示限制酶的酶切效果不太好；“X”表示限制酶酶切效果很差。
 
表1 分步酶切效果
Second
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
First EcoR I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sac I ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Kpn I ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sma I ○ ○ × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
BamH I ○ ○ ○ × × ○ × ○ ○ ○ ○ ○
Xba I ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○ ○ ○
Sal I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Acc I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Hinc II ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Pst I ○ ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○
Sse8387 I ○ ○ ○ ○ ○ ○ × × × ○ ○
Sph I ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ × ○ × ○ ×
Hind III ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
 
表2 同步酶切效果
Simultaneously
EcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH I Xba I Sal I Acc I Hinc II Pst I Sse8387 I Sph I Hind III
Simulta-neously EcoR I △ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sac I × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Kpn I × ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Sma I △ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
BamH I × ○ × ○ ○ ○ ○ ○
Xba I △ △ △ ○ ○ ○ ○
Sal I × × ○ ○
Acc I × △ ○ ○
Hinc II △ △ ○ ○
Pst I △ ○
Sse8387 I △ ○
Sph I ×
Hind III
注：
1. 對(duì)相鄰酶切位點(diǎn)的限制酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)時(shí)，同時(shí)加入限制酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)的切斷效果都不太理想，建議按先后順序加入相應(yīng)的限制酶進(jìn)行酶切反應(yīng)。
2. 使用EcoR I進(jìn)行酶切反應(yīng)時(shí)，酶切體系為20 μl，將酶的添加量控制在10 U左右，反應(yīng)時(shí)間控制在2小時(shí)左右，雙酶切效果較好。
pUC18 multi cloning site

頁(yè)面更新：2017-04-10 15:55:46