| |
| |
|
| |
| |
注意：購買632646產(chǎn)品時，需要填寫專利確認書
|
| |
| CRISPR全基因組sgRNA文庫系統(tǒng) |
· 包含超過76,000條基于Brunello文庫的sgRNAs，既可以實現(xiàn)更高的靶向特異性和靶向活性，
同時也可以保持很低的脫靶效應(yīng)點擊下載sgRNA representation data.
· 每一個人類基因?qū)?yīng)4條高活性sgRNAs, 可以通過單一模塊進行篩選
· 優(yōu)化后的sgRNA scaffold有助于加強Cas9-sgRNA之間的相互作用，實現(xiàn)高基因編輯效率
· 慢病毒sgRNA文庫已與Lenti-X Packaging Single Shots和Xfect Transfection Reagent
配制在一起，因此只需要加入水就可以獲得高效轉(zhuǎn)染混合液，用于轉(zhuǎn)染Lenti-X 293T cells
制備高滴度慢病毒sgRNA文庫
· 自失活慢病毒載體保證慢病毒制備和使用過程中高水平的生物安全性
|
| |
| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System可以使用CRISPR/Cas9在人細胞中輕松實現(xiàn)全基因組表型敲除篩選。Lenti-X Single Shots包含了全基因組sgRNA文庫和Cas9表達系統(tǒng)，可方便制備出穩(wěn)定表達Cas9和sgRNA文庫的細胞系進行每一次篩選。該sgRNA文庫是基于Brunello文庫 (Doench et al. 2016; Doench, 2018) 所構(gòu)建的，包含了超過76,000條向?qū)NA以及非靶向sgRNA對照，每一個人類基因?qū)?yīng)4條高效率sgRNAs，可對大約19,000個基因進行有效篩選。文庫篩選后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit制備NGS樣品進行新一代測序分析，此試劑盒包含了以sgRNA文庫轉(zhuǎn)導后的細胞來制備NGS樣品所必需的引物和試劑。 |
| |
| 我們精心構(gòu)建這個sgRNA文庫以確保其固有的sgRNA代表性。在文庫合成、擴增、病毒制備和靶細胞轉(zhuǎn)導每一步操作過程中，我們都會對sgRNA代表性進行檢測。Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含經(jīng)過驗證的構(gòu)建在慢病毒載體上的sgRNA文庫和Lenti-X 293T cells，這個sgRNA文庫以脫水形式提供。只需要添加水至凍干的文庫混合物中就可以獲得高效轉(zhuǎn)染混合液，然后將混合物添加至293T細胞的培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)染就可以制備獲得慢病毒粒子。每一批sgRNA文庫都通過NGS進行了檢測，確保超過90%的sgRNAs在10倍分布范圍以內(nèi)。我們也優(yōu)化了pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg載體中的sgRNA scaffold序列，有助于加強Cas9-sgRNA之間的相互作用，實現(xiàn)高基因編輯效率。本系統(tǒng)通過使用高滴度的慢病毒包裝系統(tǒng)Lenti-X Packaging Single Shots，可以有效維持慢病毒sgRNA文庫的代表性。 |
| |
| 應(yīng)用： |
· 人細胞全基因組表型篩選
· 功能缺失型遺傳篩選
|
| |
| 注意事項： |
· Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit (Code No. 632651) 包含了擴增sgRNA進行
NGS分析的所有引物和試劑，起始樣品為從篩選出的細胞群分離提取的基因組DNA，
此試劑盒可用于制備10個測序文庫（20 PCRs）。
· Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit (Code No. 632647)包含
Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit和基因組DNA純化試劑以及PCR產(chǎn)物純化試劑。 |
| |
| 參考文獻： |
Doench, J.G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nat. Rev. Genet.19, 67 80 (2018).
Doench, J.G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184 191 (2016). |
| |
| 關(guān)聯(lián)資料： |
點擊查看Guide-it™ CRISPR全基因組sgRNA文庫系統(tǒng)宣傳頁  |
| |
| Technical Notes |
|
Performing a phenotypic screen using the Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System |
| |
| CRISPR screening webinar |
| Lentiviral CRISPR/Cas9 knockout screening made simple |
| |
| |
|
| 實驗例： |
 |
圖1 Guide-it CRISPR sgRNA文庫所使用的載體和sgRNA scaffold示意圖。Panel A. 從pLVXS-EF1a-Cas9-PGK-Puro和pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg 載體圖譜中我們可以觀察到所使用的慢病毒載體骨架。這些慢病毒載體經(jīng)過了自失活處理，以提高病毒制備和使用過程中的生物安全性。pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg載體包含一個IRES連接的雙順反子表達框，可以同時表達mCherry紅色熒光標記和潮霉素抗性篩選標記。sgRNAs由人U6啟動子表達，包含經(jīng)過優(yōu)化的scaffold序列，可以高效招募Cas9，實現(xiàn)更高的基因編輯效率(Panel B)。
|
| |
 |
圖2 通過mCherry紅色熒光判斷慢病毒sgRNA文庫的轉(zhuǎn)導效率。按照用戶手冊的指導來制備慢病毒sgRNA文庫，轉(zhuǎn)染48小時后收集慢病毒粒子，以不同的MOIs轉(zhuǎn)導表達Cas9的A375細胞。接種培養(yǎng)轉(zhuǎn)導后的細胞，轉(zhuǎn)導48小時后通過熒光顯微鏡和FACS 檢測轉(zhuǎn)導效率。
|
| |
 |
圖3 Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System包含的sgRNA代表性分析。Panel A. 質(zhì)粒文庫中的sgRNA代表性分析。將基于Brunello的sgRNA文庫克隆至pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg載體并進行擴增，通過NGS驗證這個質(zhì)粒文庫中的sgRNAs代表性。檢測結(jié)果顯示，這個文庫中超過90%的sgRNAs在10倍分布范圍以內(nèi)。圖表中的柱形表示具有特定讀段數(shù)的sgRNA數(shù)量。Panel B. 比較質(zhì)粒文庫和轉(zhuǎn)導細胞中的sgRNA代表性。以潮霉素為篩選標記，篩選出Cas9+/sgRNA+ A375細胞，提取基因組DNA并進行PCR擴增。測序分析PCR產(chǎn)物，檢測PCR產(chǎn)物中每一個整合的sgRNA相對于起始質(zhì)粒DNA文庫的讀數(shù)。Spearman和Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示這兩者都具有強相關(guān)性，這說明這個系統(tǒng)無論是在經(jīng)過轉(zhuǎn)導的細胞中還是篩選后的細胞中都可以有效保持sgRNA的代表性。
|
| |
 |
圖4 使用6-硫鳥嘌呤（6-TG，一種核苷酸類似物癌癥治療藥物）作為篩選標記進行sgRNA文庫篩選的操作流程示意圖。sgRNA文庫轉(zhuǎn)導Cas9+ A375細胞后，進行潮霉素篩選、細胞擴培，之后將Cas9+/sgRNA+細胞傳代至兩個培養(yǎng)皿中。在其中一皿Cas9+/sgRNA+細胞培養(yǎng)液中添加6-TG，另外一皿細胞不添加6-TG使用常規(guī)培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。細胞擴培之后，使用Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit提取基因組DNA并制備測序樣品。
|
| |
 |
圖5 從6-thioguanine (6-TG)篩選出的細胞中分離提取sgRNAs進行鑒定分析。Panel A. 比較用于制備慢病毒的原始質(zhì)粒文庫和轉(zhuǎn)導后未經(jīng)篩選/篩選后細胞中的sgRNA代表性。作用于HPRT（紅點）和NUDT5的4條sgRNAs（黑點）均富集在6-TG篩選過的細胞中。在質(zhì)粒文庫（灰色）和轉(zhuǎn)導后未經(jīng)篩選的細胞（橘色）中，這些sgRNAs的表征也是可以檢測到的。Panel B. 在經(jīng)過6-TG篩選后的細胞中，sgRNA的代表性就發(fā)生了轉(zhuǎn)變（藍色）。在這個相關(guān)性分析中，重點標注出了被富集的單個sgRNAs（紅點和橘點）。插圖顯示了與未經(jīng)篩選的細胞相比，在篩選后的細胞中作用于HPRT的4條sgRNAs的富集倍數(shù)。
|
| |
| ■ 產(chǎn)品組份 |
| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System（Code No. 632646） |
| Guide-it Cas9 Lentiviral Transfection Mix |
5 vial |
| Guide-it Lentiviral sgRNA Library Transfection Mix |
5 vial × 2 |
| pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg Vector (0.5 μg/μl) |
10 μl |
| Lenti-X 293T Cell Line |
1 ml |
| Lenti-X GoStix Plus |
|
| · Chase Buffer |
3 ml |
| · Lenti-X GoStix Plus |
3 testes |
| · p24 Control |
5 testes |
| |
|
| Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651） |
| LVXS P5 primer pool with index 1 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 2 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 3 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 4 (10 μM) |
100 μl |
| LVXS P7 primer with index 5 (10 μM) |
100 μl |
| TaKaRa Ex Taq （5 U/μl) |
30 μl |
| 10X Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) |
500 μl |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) |
400 μl |
| |
|
| Guide-it CRISPR Genome-Wide sgRNA Library NGS Analysis Kit（Code No. 632647） |
| Guide-it CRISPR Genome-Wide Library PCR Kit（Code No. 632651） |
| NucleoBond CB 500（Code No. 740509） |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10） |
| |
|
京公網(wǎng)安備 110114000405號
