| 快速免疫沉淀試劑Capturem™ IP & Co-IP Kit | ||||||
| 品牌 | Code No. | 產(chǎn)品名稱 | 包裝量 | 價(jià)格（元） | 說(shuō)明書 | 數(shù)量 |
| Clontech | 635721 | Capturem™ IP & Co-IP Kit | 12 Rxns | ￥2,728 |
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| 基于Protein A原理的快速免疫沉淀產(chǎn)品 Capturem IP & Co-IP Kit |
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| ■ 實(shí)驗(yàn)原理 | |||||
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| Capturem Protein A 技術(shù). 每個(gè)Capturem Protein A 純化柱都含有高性能的改造過(guò)的Protein A 膜，表面積更大，與普通樹(shù)脂相比，單位ml介質(zhì)對(duì)抗體的結(jié)合能力更強(qiáng)。 | |||||
| ■ 快速純化流程 | |||||
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| 每個(gè)柱子最多可加入800 μl包含抗原抗體復(fù)合物的樣品，然后用100 μl wash buffer洗滌， 30-50 μl elution buffer洗脫。每個(gè)步驟之間僅需1,000×g離心1 min，整個(gè)操作可在15min內(nèi)完成。 | |||||
| ■ 與主流競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品提取流程對(duì)比 | |||||
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| 與主流競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品相比，使用Capturem IP & Co-IP Kit能夠顯著縮短操作時(shí)間。 | |||||
| ■ 實(shí)驗(yàn)例 | |||||
| 實(shí)驗(yàn)例1 | |||||
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| 與在本實(shí)驗(yàn)中，將NIH3T3細(xì)胞裂解液與1 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亞基抗體進(jìn)行孵育，然后上樣至Capturem Protein A純化柱。用300 μl洗滌buffer洗滌后用100 μl洗脫buffer洗脫，通過(guò)凝膠電泳分離各組分，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用抗PP2A B抗體探測(cè)。結(jié)果顯示在洗脫液中獲得了很強(qiáng)的PP2A B蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào) (52 kDa)。 注：本實(shí)驗(yàn)例所使用的buffer與Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同 (參見(jiàn)“實(shí)驗(yàn)方法：使用Capturem Protein A 純化柱進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)”)。 |
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| 實(shí)驗(yàn)方法：使用Capturem Protein A 純化柱進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn) | |||||
| 將1 μg的PP2A B亞基兔多抗與NIH3T3細(xì)胞裂解液在室溫下孵育10 min，同時(shí)不斷顛倒混合。使用400 μl的平衡/上樣 buffer（1.0 M glycine, 2 M NaCl, pH9.0）對(duì)Capturem Protein A純化柱進(jìn)行平衡，1,000×g離心1 min。將抗體-裂解復(fù)合物用裂解buffer稀釋至400 μl然后上樣，30×g離心4 min，再用100 μl的wash buffer (PBS) 洗滌，1,000×g 離心1 min。最后使用100 μl的elution buffer (0.1 M glycine, pH2.5)進(jìn)行洗脫，收集管中預(yù)先裝有10 μl的中和buffer (1 M tris，pH8.5)，1,000×g離心1 min。對(duì)各組分進(jìn)行凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用anti-PP2A B兔源多克隆抗體 (Cell Signaling) 進(jìn)行檢測(cè)。 注：實(shí)驗(yàn)中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中優(yōu)化buffer的早期配方。 |
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| 實(shí)驗(yàn)例2 | |||||
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| Capturem Protein A 產(chǎn)品具有出色的靈活性，能兼容廣泛的實(shí)驗(yàn)條件，可以與其他試劑盒中的IP buffer搭配使用。為了測(cè)試該性能，將NIH3T3細(xì)胞裂解液（100 μl，含有130 μg總蛋白）與0.6 μg蛋白磷酸酶2A (PP2A) B亞基抗體分別在IP kit A，IP kit B或獨(dú)立的裂解Buffer C中于4℃孵育1小時(shí)，總體積為400 μl。然后分別上樣至使用對(duì)應(yīng)IP buffer平衡過(guò)的Capturem Protein A純化柱，最終使用30 μl of elution buffer洗脫一次（上圖. Capturem Protein A columns A1，B1，C1），為了確保充分回收抗體復(fù)合物，重復(fù)洗脫一次（上圖. Capturem Protein A columns A2，B2，C2）。同時(shí)進(jìn)行的還有完全使用IP kit A和IP kit B的平行實(shí)驗(yàn)，按照各自的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行操作（上圖. IP Kit A，IP Kit B），上樣量及抗體用量與Capturem組相同。 結(jié)果顯示，在原始樣品（OS）中存在的組分，通過(guò)免疫沉淀操作被顯著的富集了。Capturem Protein A純化柱的結(jié)果顯示，在第一次洗脫時(shí)，無(wú)論使用何種IP緩沖液，PP2A B蛋白信號(hào)都很強(qiáng)，用低pH甘氨酸洗脫緩沖液（A1，C1）的洗脫水平最高。 注：本實(shí)驗(yàn)例所使用的buffer與Capturem IP & Co-IP Kit中提供的buffer不同（參見(jiàn)“實(shí)驗(yàn)方法：使用Capturem Protein A 純化柱進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)”）。 | |||||
| 實(shí)驗(yàn)方法：測(cè)定Capturem Protein A純化柱與不同buffer的兼容性 | |||||
| 將NIH3T3細(xì)胞裂解液（100 μl，含有130 μg 總蛋白質(zhì)）與0.6 μg的PP2A B亞基抗體在Active Motif (A) 或Thermo Fisher Scientific (B) IP試劑盒中提供的IP buffer或者是Promega 的裂解buffer (C)中進(jìn)行孵育，總體積為400 μl，于4℃孵育1 h，然后上樣至使用100 μl 對(duì)應(yīng)IP buffer平衡過(guò)的Capturem Protein A純化柱，1,000×g離心1 min，100 μl wash buffer洗滌，1,000×g離心1 min，然后使用30 μl的低pH buffer（0.1 M glycine，pH2.5，A和C）或Thermo Fisher Scientific的低pH elution buffer（B）于1,000×g的條件下離心洗脫，再重復(fù)洗脫一次，以確保完全洗脫抗體復(fù)合物。與此同時(shí)，我們也分別使用Active Motif 和Thermo Fisher Scientific 的IP 試劑盒按照說(shuō)明書的操作步驟單獨(dú)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，起始的裂解液和抗體量與使用Capturem純化柱相同。所有洗脫產(chǎn)物電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用PP2A B亞基的抗體（Cell Signaling）進(jìn)行檢測(cè)。 注：實(shí)驗(yàn)中使用的buffer是Capturem IP & Co-IP kit中優(yōu)化buffer的早期配方。 |
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| 實(shí)驗(yàn)例3 | |||||
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| p53是一個(gè)大小為53 kDa的核磷蛋白，具有抑制腫瘤的作用，并且在DNA損傷后參與抑制細(xì)胞增殖。已知野生型p53 能與幾種病毒癌基因例如SV40 T 抗原 (SV40 T) 形成特異性復(fù)合物。使用293T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)p53和SV40 T，我們證明了使用Capturem Protein A純化柱能在基礎(chǔ)水平免疫共沉淀p53和SV40 T。將Anti-SV40 T抗體加入到細(xì)胞裂解液中，室溫下孵育混合物20 min，并不斷顛倒混合。使用Capturem IP & Co-IP Kit中的優(yōu)化buffer進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，洗脫產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后使用p53和SV40 T的小鼠單抗進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，Capturem Protein A 對(duì)SV40 T的IP結(jié)果顯示對(duì)SV40 T進(jìn)行的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)在洗脫產(chǎn)物中同時(shí)檢測(cè)到了SV40 T (97 kDa) 和p53 (53 kDa)的條帶，證實(shí)了二者之間較強(qiáng)的相互作用（上圖，E-SV40 T-1和E-SV40 T-2）。
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| 實(shí)驗(yàn)方法：從293T細(xì)胞中免疫共沉淀p53和SV40 T抗原 | |||||
| 以同時(shí)表達(dá)p53 和SV40 T的293T細(xì)胞為樣本制備細(xì)胞裂解液。向100 μg的293T細(xì)胞裂解液中加入 1 μg的SV40T抗體 (兔多抗, V-300, SCBT)，室溫下孵育20 min，同時(shí)不斷顛倒混合。負(fù)對(duì)照組，裂解液在不加SV40 T抗體的情況下孵育，然后使用完整的Capturem IP & Co-IP Kit一式兩份進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)。洗脫產(chǎn)物電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜，先用SV40 T的小鼠單抗(SCBT)進(jìn)行檢測(cè)，剝離后再用p53的小鼠單抗進(jìn)行檢測(cè)(SCBT)。 |
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| ■ 應(yīng)用 | |||||
| · 免疫沉淀 · 免疫共沉淀 · 蛋白質(zhì)復(fù)合物研究 · 抗體工程研究中篩選抗原 |
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頁(yè)面更新：2024-01-25 13:26:37
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