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單細胞total RNA分析
品牌	Code No.	產(chǎn)品名稱	包裝量	價格（元）	說明書	數(shù)量
Clontech	634442	SMART-Seq^® Stranded Kit	12 Rxns	￥13,136
Clontech	634443	SMART-Seq^® Stranded Kit	48 Rxns	￥43,617
Clontech	634444	SMART-Seq^® Stranded Kit	96 Rxns	￥57,771

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SMART-Seq^® Stranded Kit

SMART-Seq^®Stranded Kit：以單細胞起始，構(gòu)建高質(zhì)量的鏈特異性RNA-seq文庫

· 操作簡便：以1–1,000個細胞或10 pg-10 ng的總RNA起始，僅需7h即可完成文庫制備；
· 高靈敏度：可以單細胞起始，保留鏈特異性，最終獲得全長總RNA序列信息；
· 高再現(xiàn)性：準確檢測包含編碼和非編碼RNA在內(nèi)的全部轉(zhuǎn)錄組；
· 用途廣泛：適用于降解的樣本；
· 適用對象：人、小鼠、大鼠。

SMART-Seq^® Stranded Kit能夠直接從1-1,000個完整細胞（或10 pg-10 ng總RNA）起始，制備鏈特異性Illumina測序文庫。本試劑采用隨機引物法可以制備完整的轉(zhuǎn)錄組文庫，并適用于部分降解及低品質(zhì)的RNA。此外，本試劑采用專有的ZapR技術(shù)，在文庫制備過程中去除核糖體cDNA。

如果是以oligo-dT引物起始對微量高品質(zhì)的RNA進行cDNA合成時，推薦使用 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing 或SMART-Seq HT Kit試劑盒。

圖1. SMART-Seq Stranded Kit的技術(shù)流程

圖2. 使用SMART-Seq Stranded Kit制備文庫的結(jié)構(gòu)特征

接頭序列包含：通過PCR 1反應添加的可以與Illumina流動池結(jié)合生成簇的P7、P5序列（P7以淡藍色表示，P5以紅色表示），用于區(qū)分單個lane上多個樣本的Index序列（Index 1 [i 7] 序列連接在P7端，Index 2 [i 5]連接在P5端）。并且還包括識別測序引物區(qū)域的Read 2（紫色）和 Read 1（綠色）。通過Read 1起始得到的原始RNA的反義鏈序列，Read 2起始獲得的是原始RNA的正義鏈序列。其中，通過Read 2起始時，前3個堿基（XXX）是SMART-Seq Stranded Adapter衍生的序列。因此在雙端測序時，需要在mapping前去掉這3個堿基。

表1.不同樣本起始量的分析結(jié)果

以人腦總RNA 10 pg至10 ng不同量起始，使用SMART-Seq Stranded Kit制備RNA-Seq文庫。該表中所顯示的數(shù)據(jù)是三次重復的平均值，且重復之間相關(guān)性系數(shù)非常高（Pearson/Spearman表示）。即使起始量為10 pg時，也具有非常高的重現(xiàn)性。

圖3. 在低起始量時，SMART-Seq Stranded Kit和Pico v2的比較

Panel A.以人腦總RNA (50 pg-10 ng)起始，分別使用SMART- Seq Stranded Kit和SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 -Pico Input Mammalian (Pico v2)制備RNA-Seq文庫（均做三次重復）。從測序數(shù)據(jù)隨機抽取250萬paired-end reads進行生物學信息分析。

Panel B.比較這兩個試劑盒在總RNA以 50 pg起始制備文庫的轉(zhuǎn)錄表達水平 (見Panel A)， SMART-Seq Stranded Kit (Pearson =0.97)的再現(xiàn)性高于Pico v2 (pearson =0.92)。

圖4. 不同起始量樣本的高重現(xiàn)性

利用FACS分離出A375細胞，分別以1-1,000個細胞起始使用SMART-Seq Stranded Kit制備測序文庫。其中，以5-1,000個細胞起始時，均做兩個重復；以單個細胞起始時，做12個重復。為了作比較，同時使用從兩種1,000個細胞中純化的總RNA制備文庫。

Panel A.：1-1,000個細胞起始的分析結(jié)果；

Panel B.：通過聚類熱圖展示了Panel A.中所示的所有樣本的Euclidea距離，以及Pearson相關(guān)系數(shù)（范圍為0.85至0.99）。其中單細胞樣本標記為Cell1-Cell12，其他樣本分別標記為a-b。

Technote：

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頁面更新：2020-04-10 11:05:54

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