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B細(xì)胞受體分析SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
品牌	Code No.	產(chǎn)品名稱(chēng)	包裝量	價(jià)格（元）	說(shuō)明書(shū)	數(shù)量
Clontech	634466	SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit	12 Rxns	￥15,150
Clontech	634467	SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit	48 Rxns	￥43,997

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無(wú)標(biāo)題文檔

SMARTer^® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
捕獲人的BCR轉(zhuǎn)錄本完整V(D)J 可變區(qū)

· 起始樣品量: 從外周血單核細(xì)胞（PBMC）純化的10 ng-1μg的總RNA或從B細(xì)胞純化的1-100 ng的總RNA
· 通過(guò)添加UMI，校正來(lái)自PCR錯(cuò)誤、重復(fù)序列以及序列錯(cuò)誤的讀取
· cDNA文庫(kù)構(gòu)建經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以靈敏、特異地檢測(cè)克隆型
· 可準(zhǔn)確擴(kuò)增并通過(guò)測(cè)序鑒別人IgG亞類(lèi)
· 經(jīng)過(guò)優(yōu)化的PCR pooling策略，可以高靈敏度地從同一樣品中檢測(cè)不同鏈
· 靈活的pooling策略適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求，以比對(duì)、識(shí)別原始鏈序列
· 可以使用Cogent NGS Immune Profiler Software進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析的完整工作流程

新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技術(shù)，提供了一種靈敏，準(zhǔn)確，優(yōu)化的BCR庫(kù)分析方法。通過(guò)5’RACE方法減少了變異性并且可以從BCR重鏈或輕鏈的恒定區(qū)引發(fā)擴(kuò)增。該試劑盒將這些優(yōu)點(diǎn)與基因特異性擴(kuò)增相結(jié)合可以捕獲BCR完整V(D)J可變區(qū)，提供了一種高靈敏度、可重復(fù)的B細(xì)胞庫(kù)分析方法。
該試劑盒設(shè)計(jì)的可以從外周血單核細(xì)胞（PBMC）純化的10 ng-1μg的總RNA或從B細(xì)胞純化的1-100 ng的總RNA，生成Illumina文庫(kù)。可以為人免疫球蛋白IgG和IgM的重鏈和輕鏈（κ和λ）生成數(shù)據(jù)。該試劑盒還包括特別的分子條形碼（UMI），從而可以消除PCR錯(cuò)誤或duplication以及測(cè)序偏向，從而確保獲得更準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。
測(cè)序結(jié)束后，可以使用Takara Bio Immune Profiler Software分析數(shù)據(jù)，該軟件使用基于UMI的糾錯(cuò)功能，并可以使用MIGEC（Shugay，2014年）和MiXCR軟件（Bolotin，2015年）。該軟件支持高質(zhì)量的BCR分析，包括克隆型計(jì)數(shù)和鑒別以及V(D)J區(qū)域的序列信息。

圖1. SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit技術(shù)流程

Panel A 第一鏈cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV衍生的SMARTScribe反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在mRNA模板5’末端添加幾個(gè)非模板核苷酸。SMART UMI Oligos與這幾個(gè)非模板核苷酸互補(bǔ)結(jié)合作為模板，通過(guò)RT在第一鏈cDNA末端添加額外核苷酸序列（也就是模板轉(zhuǎn)換步驟）。然后第一鏈cDNA經(jīng)過(guò)兩輪基因特異性的PCR擴(kuò)增（詳見(jiàn)Panel B）。第二輪的巢式PCR擴(kuò)增可以確保絕大多數(shù)的reads比對(duì)到B細(xì)胞受體的轉(zhuǎn)錄本上。

Panel B 第一輪PCR以第一鏈cDNA為模板，引物包括與Illumina Read Primer 2序列互補(bǔ)的正向引物（PCR1 Universal Forward primer），以及與BCR重鏈或輕鏈恒定區(qū)互補(bǔ)的反向引物（PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）。以Read Primer 2序列和恒定區(qū)起始，第一輪PCR特異性擴(kuò)增了BCR重鏈或輕鏈cDNA的完整可變區(qū)及部分恒定區(qū)。第二輪PCR以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，采用半巢式引物（PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）擴(kuò)增BCR重鏈或輕鏈的cDNA的完整可變區(qū)及部分恒定區(qū)。

圖2. 從1-100 ng B細(xì)胞RNA中鑒定出的克隆型信號(hào)

從1 ng，10 ng和100 ng人CD19 + B細(xì)胞總RNA中，利用本試劑盒制備BCR分析IgG，IgM，IgK和IgL文庫(kù)。為了進(jìn)行分析，對(duì)于1 ng，10 ng和100 ng的RNA起始，分別將文庫(kù)down-sampling至100,000個(gè)，400,000個(gè)和5,000,000個(gè)reads，然后利用Takara Bio Immune Profiler Software處理。

圖3. 散點(diǎn)圖展示了用1μg PBMC RNA生成的文庫(kù)之間的一致性

以來(lái)自健康供體的1μg PBMC RNA起始，一式兩份制備IgG，IgM，IgK和IgL文庫(kù)。通過(guò)down-sampling至1300萬(wàn)次讀取來(lái)分析該文庫(kù)。該圖包括來(lái)自技術(shù)重復(fù)的所有四個(gè)文庫(kù)（IgG，IgM，IgK和IgL）。

圖4. 來(lái)自不同供體的PBMC RNA的克隆型計(jì)數(shù)

對(duì)來(lái)自8個(gè)供體的10 ng PBMC RNA（不同顏色代表不同供體），分別使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit來(lái)鑒別IgG，IgM，IgK和IgL的克隆型。文庫(kù)歸一化為100,000 reads以進(jìn)行分析。

圖5. 10 ng PBMC RNA文庫(kù)的測(cè)序飽和度評(píng)估

以來(lái)自單個(gè)供體的10 ng PBMC RNA起始，使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Kit制備BCR分析文庫(kù)。

Panel A 顯示了不同測(cè)序深度的IgG克隆型計(jì)數(shù)，其中藍(lán)線和紫線分別是指經(jīng)過(guò)UMI修正誤差和沒(méi)有經(jīng)過(guò)UMI修正誤差的數(shù)據(jù)。IgG和其他鏈（IgM，IgK和IgL未在圖中展示）按每個(gè)文庫(kù)150萬(wàn)個(gè)讀數(shù)進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)down-sampling至1,000K，500K，200K，100K，50K，10K和5K reads。使用Takara Bio Immune Profiler Software分析不同測(cè)序深度的結(jié)果。

Panel B 維恩圖顯示了低測(cè)序深度（100K）和高測(cè)序深度（1,500K）的文庫(kù)之間重疊的克隆型。

Technote：
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