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當(dāng)前位置：首頁> 解決方案 > 抗體藥物篩選解決方案 > 抗體藥物篩選解決方案 > 方案一：快速調(diào)取抗體可變區(qū)scFv序列

快速調(diào)取抗體可變區(qū)scFv序列

由于抗原抗體結(jié)合的特異性取決于抗體可變區(qū)的特異結(jié)構(gòu)，所以分析可變區(qū)的序列是很多應(yīng)用的第一步，這包括以噬菌體展示技術(shù)（用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)在其外殼表面）為核心的大規(guī)模單抗篩選工作，以及對可變區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)定優(yōu)化的抗體改造等工作。
分析可變區(qū)時，設(shè)計(jì)一個通用引物來擴(kuò)增所有抗體序列是非常困難的，因?yàn)橹劓満洼p鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低，一個有效的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，后續(xù)使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進(jìn)行測序。但普通的RACE方法常有擴(kuò)增序列較短或操作步驟繁瑣的缺點(diǎn)，因此錯過了重要信息。
Takara的SMARTer RACE cDNA合成技術(shù)可為抗體可變區(qū)的全長序列分析提供簡單、靈敏、高效的解決方案。SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，結(jié)合了Clontech特別的SMARTer（5'末端RNA模板轉(zhuǎn)換機(jī)制）技術(shù)，允許反轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到轉(zhuǎn)錄本的5'末端，不需要adaptor連接等步驟，整個流程更快、更易操作，有效合成全長cDNA，大大減少了非特異性背景并提高了擴(kuò)增效率。

實(shí)驗(yàn)案例

● 快速克隆小鼠雜交瘤IgG抗體ORF

在克隆小鼠雜交瘤抗體基因之前，首先根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫注冊的小鼠lgG的序列，設(shè)計(jì)了針對H鏈, L (κ)鏈,或L (λ)鏈的反轉(zhuǎn)錄引物（RT Primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5' RACE Primer）。通過SMARTer RACE 方法從total RNA合成了第一鏈cDNA后，直接進(jìn)行5'-RACE PCR，這樣不僅可以獲得5'端序列，還可以獲得帶有可變區(qū)全部序列的cDNA片段。
培養(yǎng)并確認(rèn)小鼠雜交瘤細(xì)胞分泌由γ2a型重鏈和κ型輕鏈組成的單克隆抗體。提取total RNA，按照說明書protocol進(jìn)行第一鏈cDNA合成和5'-RACE PCR，取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
克隆擴(kuò)增產(chǎn)物至pUC118后測序。確認(rèn)序列包含單克隆抗體H鏈和L鏈N端氨基酸序列對應(yīng)的ORF。

我們對其他六種雜交瘤細(xì)胞系的抗體可變區(qū)進(jìn)行同樣的基因序列分析。獲得了所有抗體亞類的PCR產(chǎn)物。分析序列后顯示，90%的H鏈克隆和50%的L鏈克隆序列準(zhǔn)確編碼目標(biāo)抗體蛋白質(zhì)N端氨基酸序列。

【應(yīng)用SMARTer技術(shù)保護(hù)熊貓免遭滅絕】

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頁面更新：2019-11-27 14:20:04

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