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基因敲入用長單鏈DNA制備 v2
品牌	Code No.	產(chǎn)品名稱	包裝量	價(jià)格（元）	說明書	數(shù)量
Clontech	632666	Guide-it^™ Long ssDNA Production System v2	50 Rxns	￥6,647

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Guide-it Long ssDNA Production System v2可以讓您根據(jù)需求，制備長至5,000 nt的長單鏈DNA（ssDNA），作為修復(fù)模板用于多種基因組編輯技術(shù)的基因敲入實(shí)驗(yàn)。該試劑盒提供了一種簡單且快速的方法，通過選擇性消化正義鏈（sense strand）或者反義鏈（antisense strand），可以將任何序列的dsDNA PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成為ssDNA。每個(gè)試劑盒可制備50條ssDNA模板。
盡管在利用同源定向修復(fù)（HDR）進(jìn)行準(zhǔn)確基因組編輯的應(yīng)用中，單鏈DNA（ssDNA）修復(fù)模板展示出了優(yōu)于雙鏈DNA（dsDNA）模板的眾多優(yōu)勢(shì)（Roth et al., 2018）。但由于制備難度和制備成本的原因，長單鏈DNA（long ssDNA）的應(yīng)用受到了限制。Guide-it Long ssDNA Production System v2提供了一種高效經(jīng)濟(jì)的方法，可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求制備ssDNA，讓所有研究人員都可以體驗(yàn)ssDNA模板的優(yōu)勢(shì)。

與dsDNA相比，使用ssDNA作為模板的優(yōu)勢(shì)：

· 顯著減少了隨機(jī)整合和脫靶整合，從而提高了基因編輯效率，降低了出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)偽像的可能性
· 細(xì)胞毒性更低，讓您收獲到更多的編輯細(xì)胞
· 由于來自非整合模板的轉(zhuǎn)基因表達(dá)微乎其微，因此更容易識(shí)別出正確編輯克隆

與原版本產(chǎn)品Guide-it Long ssDNA Production System（Code No. 632644）相比，優(yōu)化了反應(yīng)體系，進(jìn)一步提高了鏈消化酶（Strandase）處理效率，即便是以往制備困難具有挑戰(zhàn)性的dsDNA模板，也可以高效制備ssDNA。

■ 產(chǎn)品特點(diǎn)

· 根據(jù)需求制備500–5,000 nt ssDNA供體模板，用于基因敲入實(shí)驗(yàn)
· 操作流程簡單快速，只需幾個(gè)小時(shí)即可完成
· 與dsDNA模板相比，脫靶整合顯著降低
· 細(xì)胞毒性更低，編輯后的細(xì)胞群細(xì)胞活力更高

■ 實(shí)驗(yàn)操作流程圖

圖1. 用于基因敲入實(shí)驗(yàn)的長單鏈DNA（long ssDNA）供體模板制備流程。首先，使用克隆、融合PCR或者其它方法制備dsDNA模板，dsDNA模板除了包含目的基因之外，還需要包含長度為300-600 bp的同源臂，該同源臂與目的插入位點(diǎn)左右兩側(cè)的相鄰序列相同源。接著，只在一端使用磷酸化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備兩種不同的dsDNA PCR產(chǎn)物（分別作為正義鏈ssDNA和反義鏈ssDNA制備模板）。添加鏈消化酶A（Strandase Mix A），開始消化降解正義鏈或反義鏈。由于鏈消化酶A只消化降解5'端被磷酸化的DNA鏈，所以可以有選擇性地降解正義鏈或反義鏈。然后，添加鏈消化酶B（Strandase Mix B）完成消化反應(yīng)獲得ssDNA。最后，純化反應(yīng)液，準(zhǔn)備適用于后續(xù)基因敲入實(shí)驗(yàn)的ssDNA供體。請(qǐng)注意，如果正向引物被磷酸化，則生成的ssDNA將是反義鏈；反之，如果反向引物被磷酸化，最終產(chǎn)物將是正義鏈。建議制備正義鏈和反義鏈兩種ssDNA，分別進(jìn)行基因敲入實(shí)驗(yàn)。

■ 實(shí)驗(yàn)例

圖2. Guide-it Long ssDNA Production System v2提升了挑戰(zhàn)性模板的處理能力和長至5,000 nt單鏈DNA的制備能力。Guide-it Long ssDNA Production System v2可成功制備長度為500 nt至5,000 nt的ssDNA。凝膠圖顯示了不同長度的dsDNA底物（泳道1），經(jīng)過酶消化和純化后相對(duì)應(yīng)的正義（SS）和反義（AS）ssDNA產(chǎn)物（泳道2）。每個(gè)ssDNA HDR模板均設(shè)計(jì)為靶向CCR5基因。

圖3. Guide-it Long ssDNA Production System v2優(yōu)化了ssDNA制備效率，可更有效處理具有挑戰(zhàn)性的dsDNA模板。凝膠圖顯示了幾種HDR模板的dsDNA起始材料（Lane 1）和正義（SS）或反義（AS）ssDNA產(chǎn)物，這些ssDNA分別使用了Guide-it Long ssDNA Production System原版本產(chǎn)品（v1）或升級(jí)版本產(chǎn)品（v2）進(jìn)行制備（ Lane 2和Lane 3）。對(duì)于v1 Guide-it試劑盒，本實(shí)驗(yàn)例所包含的dsDNA模板，已被鑒定為具有挑戰(zhàn)性的ssDNA制備底物，很難制備出高純度ssDNA。以溴化乙錠為染色劑，采用瓊脂糖凝膠電泳法分析dsDNA和ssDNA。ssDNA產(chǎn)物的分子量要比相應(yīng)dsDNA底物的分子量小。在所有情況下，Guide-it Long ssDNA Production System v2制備的ssDNA條帶比v1版本更清晰，表明消化更完全、更均勻。

■ 產(chǎn)品組份

Guide-it Long ssDNA Production System v2（Code No. 632666）

· Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2（Code No. 632667）*
	PrimeSTAR Max Premix (2X)	625 μl × 4
	Strandase Mix A	250 μl
	Strandase A/B Buffer (10X)	250 μl
	Strandase Mix B	50 μl
	Digestion Enhancer (5X)	500 μl
	RNase Free Water	1 ml × 5
	2-kb Control Template (2 ng/μl)	50 μl
	Control Primer Mix (16 μM)	50 μl
· NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit (Code No. 740609.50)		50次 × 2
· Buffer NTC（Code No. 740654.100）		125 ml

* 本產(chǎn)品不單獨(dú)出售。

■ 保存條件

Guide-it Long ssDNA Strandase Kit v2 (Code No. 632667)	－20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Code No. 740690.50)	室溫
Buffer NTC（Code No. 740654.100）	室溫

■ 關(guān)聯(lián)資料

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頁面更新：2020-07-13 11:45:56

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