| ■ SMARTer技術(shù)——升級(jí)的全長cDNA合成方法 |
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眾所周知，一個(gè)基因會(huì)不只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)。所以，為了得到同一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的不同轉(zhuǎn)錄本的更多信息，獲取5'-和 3'-序列信息是很重要的。通過全長cDNA可以得到這些末端序列的特異信息，這樣可以了解到關(guān)于轉(zhuǎn)錄變異體的更好的數(shù)據(jù)。研究者經(jīng)常通過Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)來獲取RNA轉(zhuǎn)錄子的全長序列。如果您只研究幾個(gè)基因，那么RACE是比下一代測(cè)序（NGS）更經(jīng)濟(jì)的方法。
SMARTer RACE 5'/3' Kit（Code No. 634858/59）是優(yōu)化升級(jí)的試劑盒，具有更高的靈敏、更低的背景和更高的特異性。采用SMART技術(shù)，以poly A+ 或總RNA為起始，合成的第一鏈cDNA可直接進(jìn)行5′和3′RACE-PCR，不需要adaptor連接等步驟，整個(gè)流程更快、更易操作。SMART RACE 還結(jié)合了強(qiáng)有力的抑制性PCR，顯著地減少了RACE實(shí)驗(yàn)中的彌散現(xiàn)象，是獲得全長cDNA的有效方法。 |
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| 圖1. SMARTer cDNA合成的原理。使用修飾的oligo (dT)引物進(jìn)行第一鏈合成，SMARTScribe反轉(zhuǎn)錄酶到達(dá)mRNA模板末端之后，會(huì)自動(dòng)添加幾個(gè)非模板的堿基，SMARTer II A Oligonucleotide會(huì)與cDNA尾部結(jié)合，作為SMARTScribe反轉(zhuǎn)錄酶的模板進(jìn)行進(jìn)一步的延伸。 |
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| 圖2. SMARTer RACE 5'/3' kit流程示意圖。每個(gè)試劑盒即一個(gè)完整的系統(tǒng)，包含了第二天克隆RACE片段的全部試劑。 |
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| ■ SMARTer cDNA合成方法的優(yōu)勢(shì) |
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| ■ SMARTer RACE方法：一個(gè)試劑盒即可完成合成，克隆，確認(rèn) |
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SMARTer RACE 5'/3' Kit（Code No. 634858/59）包含了除基因特異性引物外的所有組分，流程更精簡。使用這一個(gè)試劑盒，即8小時(shí)內(nèi)完成第一鏈cDNA合成到克隆RACE片段的流程，并在第二天就可以挑取克隆進(jìn)行分析(圖 2)。
除了核心SMARTer試劑，試劑盒還包含了性能優(yōu)良的SeqAmp DNA Polymerase，對(duì)于長片段或高GC含量等高難度片段的擴(kuò)增也適用。(圖 3, 表1)。 |
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| 圖3. 升級(jí)版RACE試劑盒與舊版產(chǎn)物對(duì)比。引物根據(jù)說明書中推薦方法設(shè)計(jì)。通過電泳圖上可以看出檢測(cè)到寬廣范圍內(nèi)的表達(dá)值，合計(jì)外顯子長度大于10 kb。目標(biāo)基因的確認(rèn)、長度和GC含量在表1中顯示。升級(jí)版試劑盒可以更成功地?cái)U(kuò)增出單一清晰條帶。 |
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SMARTer RACE 5'/3' Kit包含了NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit用于純化PCR產(chǎn)品, 高效無縫克隆In-Fusion HD Cloning Kit, 高效率感受態(tài)細(xì)胞Stellar Competent Cells。由SeqAmp DNA Polymerase擴(kuò)增的PCR片段是平末端，可更好地使用In-Fusion方法進(jìn)行克隆，即使片段較大的情況下，In-Fusion方法的克隆效率也很高。
試劑盒中還包含了兼容In-Fusion方法的線性化克隆載體，試劑盒中的引物是與該載體引物特異性匹配的。您需要按照說明書中的指南來設(shè)計(jì)基因特異性引物，這樣才能保證特異性地克隆目標(biāo)5'-或3'-RACE片段。
共同使用這些試劑，SMARTer cDNA合成技術(shù)和In-Fusion克隆技術(shù)的高效性創(chuàng)造了一個(gè)極其快速、優(yōu)化的系統(tǒng)，在兩天內(nèi)即可由RNA獲得成功的克隆，用于后續(xù)分析。 |
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| 表1. 使用升級(jí)版試劑盒擴(kuò)增的5'-RACE片段數(shù)據(jù)。圖3左側(cè)電泳圖中的擴(kuò)增子使用SMARTer RACE 5'/3' Kit中克隆相關(guān)試劑克隆并測(cè)序，并比對(duì)檢測(cè)到了額外的之前沒有注釋的堿基信息（表中最右列）。 |
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| ■ SMARTer RACE方法的新應(yīng)用 |
| >> 抗體可變區(qū)的快速克隆 |
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| >> SMARTer RACE在CAR-T研究中的應(yīng)用 |
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| >> LncRNA未知序列調(diào)取 |
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