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| 應(yīng)用SMART® 技術(shù)快速克隆抗體可變區(qū) |
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| SMARTer RACE cDNA Amplification |
· 合成含有可變區(qū)全長序列的cDNA片段
· 輕松準(zhǔn)確地克隆和分析多種抗體基因
· 改進(jìn)RACE PCR實(shí)驗(yàn)，更容易操作，無需連接酶克隆 |
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| 升級的全長cDNA合成方法 |
單克隆抗體已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種科學(xué)研究和診斷，而確切的抗原特異性是研究的關(guān)鍵點(diǎn)。另外，由于抗體工程（如嵌合抗體和人源抗體的發(fā)展）的進(jìn)步，抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，將單克隆抗體直接應(yīng)用于治療的可行性越來越高。
由于抗原抗體特異性取決于抗體可變區(qū)的特異結(jié)構(gòu)，分析可變區(qū)的序列是很多應(yīng)用中的第一步，包括無動物系統(tǒng)的抗體生產(chǎn)，抗體作為藥物的研究，以及工程化抗體類似物的生產(chǎn)等。利用SMART cDNA合成技術(shù)和精簡的流程，SMARTer RACE kits提供了一個快速、簡便地分析這些重要的變化序列的方法。 |
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| 可變區(qū)序列分析的解決方案 |
免疫系統(tǒng)可以生產(chǎn)1億種抗體來對抗外界入侵物質(zhì)。 抗體的這種多樣性通過淋巴細(xì)胞發(fā)育中V(D)J的重組而形成。抗體分子包含重鏈和輕鏈，重鏈和輕鏈又分別包含可變區(qū)和保守區(qū)，V(D)J 重組是可變區(qū)與其他基因序列幾乎隨機(jī)的重新組合。這個過程會生成特異的抗原受體。由于可變區(qū)位于重鏈和輕鏈的N端，且決定了抗原抗體的親和性，分析這段區(qū)域非常重要。
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| Figure 1. Basic antibody structure. |
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分析可變區(qū)時，設(shè)計一個通用引物來擴(kuò)增所有的抗體序列是異常困難的。重鏈和輕鏈5’端的天然可變性決定了序列同源性很低。一個有效的分析這些可變區(qū)域的方法是在可變區(qū)下游的保守區(qū)設(shè)計簡并引物。后續(xù)可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆這段目的區(qū)域，之后再進(jìn)行測序。使用SMARTer RACE kits具有足夠的靈敏度，可以獲得全部5’端的信息。
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| SMARTer技術(shù)在RACE應(yīng)用中的優(yōu)勢 |
使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄過程中將SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端。該過程結(jié)合了Clontech特別的SMART（RNA模板5'末端的轉(zhuǎn)換機(jī)制）技術(shù)，允許反轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到轉(zhuǎn)錄本的5'末端。大多數(shù)其他RACE PCR方法都沒有捕獲5'端，因此錯過了重要信息。此外，在5'末端添加SMART序列使得該位點(diǎn)能夠用于下游擴(kuò)增和克隆。 SMARTer RACE組分和流程的優(yōu)化大大減少了非特異性背景并提高了擴(kuò)增效率。即使樣品被基因組DNA污染，強(qiáng)大的系統(tǒng)也能獲得可靠的結(jié)果，適用于廣泛的應(yīng)用。用高保真聚合酶擴(kuò)增cDNA片段確保了有效分析所需的核苷酸序列的準(zhǔn)確復(fù)制。
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| 小鼠雜交瘤來源抗體基因的快速克隆 |
在克隆小鼠雜交瘤抗體基因之前，首先根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫注冊的小鼠lgG的序列，設(shè)計了針對H鏈, L (κ)鏈, 或L (λ)鏈的反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer）以及RACE PCR所需的反向引物（5' RACE primer）。通過SMARTer RACE方法從total RNA合成了第一鏈cDNA后，直接進(jìn)行5'-RACE PCR，這樣不僅可以獲得5’端序列，還可以獲得帶有可變區(qū)全部序列的cDNA片段。
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| Figure 2. Experimental workflow for 5′-RACE PCR of the antibody variable domain using the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit. |
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培養(yǎng)并確認(rèn)小鼠雜交瘤細(xì)胞分泌由γ2a型重鏈和κ型輕鏈組成的單克隆抗體。提取total RNA，按照說明書protocol進(jìn)行第一鏈cDNA合成和5'-RACE PCR，取一部分PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。
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| Figure 3. Confirmation of successful amplification of antibody genes from mouse hybridomas. |
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克隆擴(kuò)增產(chǎn)物至pUC118后測序。確認(rèn)序列包含單克隆抗體H鏈和L鏈N端氨基酸序列對應(yīng)的ORF。
我們對其他六種雜交瘤細(xì)胞系的抗體可變區(qū)進(jìn)行同樣的基因序列分析。獲得了所有抗體亞類的PCR產(chǎn)物。分析序列后顯示，90%的H鏈克隆和50%的L鏈克隆序列準(zhǔn)確編碼目標(biāo)抗體蛋白質(zhì)N端氨基酸序列。
某些實(shí)驗(yàn)中，得到的克隆與目標(biāo)抗體具有序列同源性，但由于其序列中存在終止密碼子，因此不能編碼功能性抗體的ORF。另外，我們懷疑一個特定的克隆含有用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物，因?yàn)樵撔蛄惺菑亩鄠€雜交瘤中獲得的。
與編碼靶單克隆抗體的序列相比，一些雜交瘤產(chǎn)生了具有該共同序列的更多克隆。基于這些結(jié)果，顯然應(yīng)該將靶抗體的N-末端氨基酸序列的分析和確認(rèn)與DNA序列分析平行進(jìn)行。
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| Figure 4. Amplification of various subclasses of mouse antibody genes. |
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| SMARTer RACE cDNA的進(jìn)一步改良，更簡化的克隆流程 |
為了優(yōu)化RACE流程，我們對SMARTer RACE Kit做了重大更新。上述數(shù)據(jù)是通過聯(lián)合使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase用于PCR，Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) 用于連接和克隆。
之后對產(chǎn)品升級，得到的SMARTer RACE 5'/3' Kit (Code No. 634858, 634859)，具有同樣的SMARTer核心技術(shù)，并在反應(yīng)條件和下游克隆方面進(jìn)行了進(jìn)一步的改良。
新試劑盒包含了SMARTer RACE實(shí)驗(yàn)所需的所有組分（除了基因特異性引物外）。
通過將SMARTer II A寡核苷酸與SMARTScribe™ 反轉(zhuǎn)錄酶配對，獲得高靈敏度和特異性以及低背景的結(jié)果。
SeqAmp™ DNA聚合酶提供了強(qiáng)大的PCR性能，在擴(kuò)增長或富含GC的挑戰(zhàn)性靶序列時尤其有效。
SMARTer RACE 5'/ 3'試劑盒的組成部分之一是In-Fusion® HD Cloning Kit，它可以在不使用連接酶的情況下輕松、準(zhǔn)確地克隆5'-RACE片段。該試劑盒中還提供了與In-Fusion技術(shù)兼容的線性化載體，并且試劑盒中所包含的引物專門設(shè)計用于匹配該載體。 In-Fusion克隆方法非常高效，非常適合所有克隆應(yīng)用。通過將這項(xiàng)技術(shù)與成熟的SMARTer RACE方法配合，從RNA到克隆只需要兩天時間就可以進(jìn)行分析。 |
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| 結(jié)論 |
SMARTer RACE cDNA合成為抗體可變結(jié)構(gòu)域的全長序列分析提供了靈敏、簡化的解決方案。這些可變區(qū)的多樣性雖然對有效免疫應(yīng)答至關(guān)重要，但對于希望分析這些基因片段以進(jìn)行廣泛研究（包括藥物開發(fā)）的研究人員來說，這是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。
獲得該序列后，使設(shè)計具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性、改善的親和力或雙重特異性的抗體成為可能。抗體可變區(qū)的評估是這些研究和許多其他抗體修飾的第一步，SMARTer 5'-RACE PCR是用于克隆這些靶序列進(jìn)行測序的有效方法。
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SMARTer RACE 5'/3' Kit
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