| Oligo合成課堂第一期 Oligo的化學(xué)合成 | |||||||||
| · Oligo合成技術(shù)發(fā)展史 | |||||||||
| Oligo即寡核苷酸鏈，在生物學(xué)各領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛，我們常用的測序引物、PCR & qPCR的引物探針、NGS捕獲探針、FISH探針等都屬于Oligo范疇。根據(jù)功能不同，可以在Oligo上修飾熒光基團、淬滅基團和化學(xué)基團（如，氨基、巰基等）等。 DNA合成技術(shù)是合成生物學(xué)及生物制造領(lǐng)域的關(guān)鍵底層共性技術(shù)。Oligo的化學(xué)合成始于20世紀50年代： |
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| · Oligo合成步驟 | |||||||||
| 固相亞磷酸三酯法，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。該方法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，合成方向是由待合成序列的3’端向5’端進行，相鄰的核苷酸通過3’-5’磷酸二酯鍵連接。 | |||||||||
1、脫去DMT基團：使用二氯乙酸或者三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除預(yù)先連接在固相載體上的末端核苷酸的5'-DMT保護基團，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。 2、偶聯(lián)：待合成的亞磷酰胺單體與活化劑四唑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體，它的3’端被活化，5’-羥基仍然被DMT保護；脫保護的5'-OH會與亞磷酰胺四唑活性中間體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成亞磷酸三酯鍵，在這一步核苷酸鏈得到延伸。 3、帶帽（capping）反應(yīng)：雖然偶聯(lián)的效率可以達到99%以上，但仍有一些已經(jīng)脫保護的5'-OH沒有參與反應(yīng)。為了防止這些5'-OH與下一個循環(huán)加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生N-1雜質(zhì)，需要對未參與偶聯(lián)的5'-OH加帽。一般常用乙酸酐和N-甲基咪唑形成乙酰化試劑，與未參與偶聯(lián)反應(yīng)的 5'-OH形成酯鍵。 4、氧化：偶聯(lián)反應(yīng)生成的亞磷酯鍵易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。 通過上述步驟，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體的核苷酸上了。再重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被連接上去。 5、切離、脫保護：將連接在CPG上的引物切下來，再經(jīng)過高溫處理，脫去堿基上氨基的保護基團。 6、純化：切下來的Oligo粗品根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x擇不同的純化手段進行純化。 |
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| 由于隨著鏈延長所帶來的化學(xué)反應(yīng)效率、合成純度以及產(chǎn)率的下降，目前化學(xué)方法合成的Oligo長度一般不會超過200個核苷酸（nt）。 | |||||||||
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| 化學(xué)合成技術(shù)發(fā)展至今，技術(shù)越來越成熟，合成效率也在不斷提高，柱合成、高通量合成都獲得了長足的發(fā)展。 | |||||||||
| · Takara Oligo合成的優(yōu)勢 | |||||||||
| 對核酸合成來說，最為重要的因素包括：合成用的核酸單體、合成用的固定相載體，以及合成過程的工藝參數(shù)控制。 Takara采用進口的先進合成儀，能夠進行單柱合成及高通量合成，滿足不同引物、探針的制造需求： |
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| 優(yōu)質(zhì)的原材料才能獲得高質(zhì)量的產(chǎn)品， Takara合成的主要原料均為進口原料，奠定了我們高品質(zhì)產(chǎn)品的基石。 很多化學(xué)合成原料對環(huán)境的溫度和濕度較敏感，通過對實驗室溫濕度控制，減少環(huán)境對原料和偶聯(lián)反應(yīng)的影響，提高生產(chǎn)效率，有效的保障產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。而純化過程在Cleanroom中進行，可以滿足較高的防污染需求。 寶生物工程（大連）有限公司通過了ISO13485認證，所有的制造流程都嚴格遵守標準操作程序，滿足IVD企業(yè)的生產(chǎn)需求。 經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員、先進的設(shè)備、優(yōu)質(zhì)的原料、嚴格的生產(chǎn)流程、精細的環(huán)境控制，從人機料法環(huán)全方位提升才是立足市場的有力保障。 |
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| Takara有著近三十年的合成歷史，在Oligo DNA/RNA合成，特別是各種修飾與標記DNA/RNA的合成方面積累了豐富的經(jīng)驗。 我們能夠提供單批次2-30,000 OD的高質(zhì)量引物探針，日產(chǎn)能達到30,000 OD。大規(guī)模合成能力，滿足客戶大量生產(chǎn)需求，減少批間差。 我們目前合成的修飾品種多達200多種，并且還在不斷的增加中。除了普通的測序引物、PCR & qPCR的引物探針合成以外，NGS測序引物、FISH探針、LNA、MGB-E修飾雙標記探針，以及雙淬滅探針等等Oligo的合成，Takara都有成熟的制造工藝，滿足客戶需求。同時Takara推出定制化生產(chǎn)線，對客戶的特殊要求提供定制合成服務(wù)。 目前我們可將HRP（辣根過氧化物酶），鏈霉親和素及人工合成多肽連接到Oligo DNA鏈上；解決了rApp修飾接頭標記效率低等問題，提供高質(zhì)量的small RNA高通量測序文庫腺苷酸化接頭；G豐富序列，甚或Poly G序列等，我們也有著有效的解決方案。 |
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| 寡核苷酸和長核苷酸的合成取得了驚人的進展。DNA合成的更快周轉(zhuǎn)時間、更高準確性和成本的急速下降已經(jīng)成為可能，這種趨勢一定會在未來繼續(xù)下去。 | |||||||||
| 附： Takara Oligo合成list |
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頁面更新：2023-07-05 16:31:33
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