| Oligo合成課堂第二期─Oligo的純化 |
| 上期我們介紹了Oligo的化學(xué)合成，亞磷酰胺法是商業(yè)化Oligo合成的主流方法。實(shí)際合成生產(chǎn)中，不管條件如何，偶聯(lián)步驟中都會(huì)有一些寡核苷酸不會(huì)與新引入的核苷酸反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生短的寡核苷酸鏈，而且這種短的寡核苷酸鏈在統(tǒng)計(jì)學(xué)上會(huì)隨著每個(gè)合成的循環(huán)而積累。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，限制了可以通過化學(xué)合成得到較長長度的、高純度的寡核苷酸鏈。目前化學(xué)方法合成的Oligo長度一般不會(huì)超過200個(gè)核苷酸（nt）。而合成的粗產(chǎn)物中，除了反應(yīng)不完全的短寡核苷酸鏈，還有反應(yīng)生成的鹽、丙烯腈，脫保護(hù)過程中剩余的氨等等。這些“雜質(zhì)”的存在，不但造成定量不準(zhǔn)確，而且有礙下一步的反應(yīng)，因此合成后的寡核苷酸鏈需要進(jìn)一步純化，為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，選擇適當(dāng)?shù)姆椒兓疧ligo是十分關(guān)鍵的。 |
| 目前常用的純化方式有OPC純化、PAGE純化和HPLC純化等。 |
| 固相亞磷酸三酯法，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，合成方向是由待合成序列的3’端向5’端進(jìn)行，相鄰的核苷酸通過3’-5’磷酸二酯鍵連接。 |
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| 1. OPC（寡核苷酸純化柱）純化 |
| 因OPC中的吸附劑對(duì)DMT基團(tuán)有親和力，分離的基礎(chǔ)是依據(jù)目標(biāo)序列（帶有DMT基團(tuán)）與短序列（沒有DMT基團(tuán)）疏水性的差別。當(dāng)所有的寡核苷酸鏈被吸附在色譜柱上后，用有機(jī)溶劑洗脫，沒有DMT基團(tuán)的短鏈Oligo吸附能力弱，很容易就被洗脫下來，而帶有DMT基團(tuán)的目標(biāo)序列則保留在柱內(nèi)，從而達(dá)到脫鹽純化的目的。最后，利用脫保護(hù)步驟將目標(biāo)序列與DMT分離，收集得到最終的純化產(chǎn)物。該純化方式獲得的Oligo DNA純度≥85%（GB/T 34797-2017）。純化后的產(chǎn)品可用于普通PCR、測序、克隆等實(shí)驗(yàn)。 但該方法對(duì)于較目標(biāo)序列短幾個(gè)堿基的片段，去除效果并不是很好，產(chǎn)率較低。也不適用于40 mer以上的寡核苷酸鏈的純化。 |
| 2. PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）純化 |
| PAGE純化分離的依據(jù)是分子量和電荷，是一種常用的寡核苷酸純化方式。在電場作用下，不同長度序列的遷移速率不同，通過控制電壓和電流，達(dá)到分離的目的。另外，分子形狀、親疏水性、分子大小、凝膠基質(zhì)的相互作用等也能影響分子的遷移速率。 電泳結(jié)束后，將分離后的目的條帶切膠回收。PAGE純化具有很高的分辨率，對(duì)于N-1的去除非常有效，尤其適合長序列（＞60 mer）的純化。一般情況下，PAGE純化的寡核苷酸純度≥90%（GB/T 34797-2017），有些樣品的純度甚至能夠達(dá)到95%以上。所以，PAGE純化寡核苷酸的應(yīng)用更為廣泛，如qPCR、反義核酸、基因芯片、基因合成等方面。 |
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| 圖1 PAGE檢測結(jié)果 |
| PAGE純化純度較高，但依賴于人工切膠，不易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。并且電泳裝置上樣量小，限制了PAGE純化的規(guī)模。 |
| 3. HPLC（高效液相色譜法）純化 |
| 高效液相色譜法（HPLC）將寡核苷酸的定量分析和純化結(jié)合起來。根據(jù)分子的親水性（反相）和電荷（離子交換）方面的差異分離目標(biāo)寡核苷酸。HPLC純化和OPC純化方法在原理上頗為接近，也是利用5'端DMT保護(hù)基團(tuán)與其他不帶保護(hù)基團(tuán)的Oligo在色譜柱上吸附能力不同達(dá)成分離純化的目的。在洗脫過程中，可以通過改變液體流動(dòng)相中不同組分的配比來實(shí)現(xiàn)梯度洗脫。 HPLC用于寡核苷酸純化主要有兩種方法：陰離子交換色譜法（IE-HPLC）和反相色譜法（RP-HPLC）。 IE-HPLC是在既定的pH條件下，根據(jù)不同組分的離子電荷情況和等電點(diǎn)的不同，將其分離開來的一種液相色譜技術(shù)。DNA分子帶負(fù)電，而固定相帶正電。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，與固定相樹脂形成電荷相互作用。較長的片段由于帶有更多的電荷，與樹脂的電荷相互作用力更大，流動(dòng)速度慢。當(dāng)短片段流出色譜柱時(shí)，長片段依然在色譜柱內(nèi)，最后用洗脫液將目標(biāo)序列洗脫。 RP-HPLC是一種采用非極性鍵合固定相，以及極性強(qiáng)于固定相的溶劑系統(tǒng)為流動(dòng)相的液相色譜分離形式。反相色譜固定相表面鍵合疏水基團(tuán)。樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的強(qiáng)弱不同：極性較強(qiáng)或親水的樣品分子與固定相之間相互作用較弱，容易被洗脫；而極性較弱或疏水的分子與固定相之間有較強(qiáng)的相互作用，保留時(shí)間較長。這一方法使得分離過程中帶有DMT基團(tuán)的全長目的序列容易與不帶DMT基團(tuán)的短序列分離。 高效液相色譜法（HPLC）的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化水平高、可定量分離產(chǎn)品、容易回收純品、分辨率高。HPLC純化的寡核苷酸純度≥95%（GB/T 34797-2017）。 |
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| 圖2 HPLC純度檢測結(jié)果 |
| HPLC純化產(chǎn)物由于純度高、產(chǎn)率高，所以在生物領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，也是生物企業(yè)大批量生產(chǎn)選擇的主要純化方式。 |
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各應(yīng)用領(lǐng)域使用的Oligo產(chǎn)品對(duì)純度的要求不盡相同，純度未必是越高越好，選擇合適的純化方式才是性價(jià)比最高的。 |
| 除了不同的純化方式對(duì)純度的影響以外，Oligo長度、特殊序列（形成高級(jí)結(jié)構(gòu)）等因素，也會(huì)影響最終的產(chǎn)品純度。因此，對(duì)于一些特殊樣品，Takara公司會(huì)根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)選解決方案，使用但不限于以上單一的純化方式，PAGE、HPLC、甚至雙純化；提供但不限于國標(biāo)要求純度的產(chǎn)品。一些檢測試劑盒等對(duì)Oligo的純度要求很高，Takara公司有特殊定制服務(wù)，可提供超越國標(biāo)要求純度的產(chǎn)品。提供客戶滿意的優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品是Takara不變的服務(wù)宗旨。 |
頁面更新：2023-11-02 10:35:28
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