| Oligo合成課堂第三期 Oligo的準(zhǔn)確定量 |
| 在Oligo的應(yīng)用中，使用者一般更關(guān)注Oligo純度等因素對實(shí)驗(yàn)的影響，往往忽略了一個(gè)重要因素：定量。Oligo的準(zhǔn)確定量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響也是至關(guān)重要的。 |
| 那么，定量不準(zhǔn)確到底都有哪些影響呢？（以實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的引物探針為例） |
| 首先，對Ct值的影響。引物探針添加量不足，往往會(huì)造成Ct值滯后的情況，如圖一： |
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| 圖一 引物探針添加量不足造成Ct值滯后 |
| 其次，對熒光信號值的影響。探針添加量不足或過多，對于最終的熒光信號值也會(huì)有比較大的影響。如圖二： |
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| 圖二 探針添加量較多造成熒光信號值過高 |
| 第三，對融解曲線的影響。當(dāng)引物設(shè)計(jì)不是很理想時(shí)，加入過量的引物，可能會(huì)形成較多的引物二聚體，造成融解曲線雙峰，如圖三： |
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| 圖三 引物添加過多造成融解曲線雙峰 |
| 第四，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。由于不定量或不能準(zhǔn)確定量，往往會(huì)造成批次間實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性略差，如圖四： |
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| 圖四 批間實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大 |
| 以上是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中比較普遍的現(xiàn)象，定量不準(zhǔn)確的影響還有很多。所以，Oligo使用前的準(zhǔn)確定量，是保障實(shí)驗(yàn)成功和減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差的一個(gè)很重要的因素。Takara有著嚴(yán)格的定量及分裝流程，有效控制Oligo批間差，確保質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定。 |
| 那么，如何對Oligo進(jìn)行定量？ |
| 目前普遍采用分光光度法，其原理是由于Oligo中的堿基之間存在共軛雙鍵，共軛雙鍵對光具有強(qiáng)吸收的特點(diǎn)，因此當(dāng)測量吸收光譜時(shí)，在波長260nm或接近260nm處都有一個(gè)吸光度（Absorbance, A260），通過對吸光度的測定，來對樣品進(jìn)行定量。 測定設(shè)備使用比較廣泛的是紫外/可見分光光度計(jì)，比如：UV-1800、NanoDrop系列等。 Oligo DNA/RNA定量的計(jì)算方法也有很多種：有通過A260值和摩爾消光系數(shù)計(jì)算的，也有通過分子量來計(jì)算的。不同計(jì)算方法獲得的結(jié)果之間是有差別的。 |
| 不同的計(jì)算方法造成了Oligo DNA/RNA在定量方面存在以下兩個(gè)問題： |
| 一是系統(tǒng)誤差：不同的定量儀器存在系統(tǒng)偏差； 二是計(jì)算方法誤差：不同的摩爾濃度計(jì)算方法存在偏差。 鑒于以上情況，Takara對Oligo DNA/RNA的定量進(jìn)行了一系列的研討，希望能夠找到更為準(zhǔn)確、偏差更小的Oligo DNA/RNA測定和計(jì)算方法，避免由于定量不準(zhǔn)確造成實(shí)驗(yàn)失敗和重復(fù)性差的風(fēng)險(xiǎn)。 |
| 在定量過程中，一些常用的參數(shù)如下： |
| 1、OD：光密度，表示被檢測物吸收掉的光密度。 1 ml體積1 cm光程標(biāo)準(zhǔn)比色皿中，260nm波長下吸光度為1 A260的Oligo溶液定義為1 OD，所以O(shè)D260值= A260值。 |
| 2、摩爾消光系數(shù)(Molar Extinction Coefficient)ε：是指濃度為1摩爾/升時(shí)的吸光系數(shù)，用 ε 表示。 對于Oligo DNA/RNA，當(dāng)序列和修飾基團(tuán)確定的情況下，摩爾消光系數(shù)ε也就確定了。 注：該數(shù)據(jù)在Takara制品包裝內(nèi)附的Oligo Data Sheet上提供。 |
| 3、平均質(zhì)量：1個(gè)OD值的合成DNA/RNA的質(zhì)量。 1個(gè)OD260值的Oligo DNA（ssDNA）的平均質(zhì)量約為33 μg 1個(gè)OD260值的雙鏈DNA（dsDNA）的平均質(zhì)量約為50 μg 1個(gè)OD260值的RNA的平均質(zhì)量約為40 μg 平均質(zhì)量依據(jù)的是在序列中四種堿基占比一致，即1:1:1:1，但實(shí)際上，合成的Oligo產(chǎn)品一般序列較短，比例之間差異較大，因此實(shí)際質(zhì)量與平均質(zhì)量之間也會(huì)有比較大的差異， 例如： 5’-AAA AAA AAA A-3’ 24.88 μg/OD260 5’-GGG GGG GGG G-3’ 31.54 μg/OD260 5’-CCC CCC CCC C-3’ 39.19 μg/OD260 5’-TTT TTT TTT T-3’ 36.52 μg/OD260 因此定量計(jì)算過程中，如果引入了平均質(zhì)量這個(gè)參數(shù)，那么后續(xù)計(jì)算得到的濃度會(huì)有一定的偏差。 |
| Oligo產(chǎn)品在訂購時(shí)，常用訂購單位為OD，但在實(shí)驗(yàn)過程中使用的是摩爾濃度，所以O(shè)D與摩爾數(shù)之間需要進(jìn)行換算，常用的換算公式有兩種： ①nmol ＝ 106 × OD/ε ②nmol ＝ （OD×33/堿基數(shù)×330）103 “33”為1 OD的Oligo DNA的平均質(zhì)量為33μg “330”為每個(gè)堿基的平均分子量按330道爾頓計(jì)算。 公式②中兩個(gè)平均值造成該公式的偏差較大，只能作為粗略計(jì)算，因此，更推薦使用公式①。 |
| 為了您使用方便，Takara在產(chǎn)品的包裝標(biāo)簽上會(huì)注明該最小包裝中所含Oligo的OD值和nmols，您可以根據(jù)標(biāo)注的nmols來進(jìn)行溶解稀釋。溶解稀釋后的產(chǎn)品，此時(shí)所知的濃度為理論濃度，Takara建議您進(jìn)行復(fù)測，以確保使用時(shí)添加量準(zhǔn)確。 市面上的定量設(shè)備很多，使用較為廣泛的是Nanodrop系列設(shè)備，因此針對Nanodrop設(shè)備的測定，Takara進(jìn)行了研討，最終確定了較為準(zhǔn)確的測定和計(jì)算方法。 |
| 1、樣品的稀釋 |
| 開蓋前須先離心，使制品集中于管底；根據(jù)需要，使用滅菌水或TE Buffer（pH7.5～8.0）進(jìn)行溶解（標(biāo)記探針在TE Buffer中溶解更穩(wěn)定） 1）根據(jù)標(biāo)簽信息將樣品稀釋至100 μM：將干粉配制成100 μM溶液，加入溶劑的體積為 V(μl)=nmol數(shù) × 10 2）測定前，進(jìn)一步稀釋至合適濃度。如NanoDrop系列設(shè)備，建議將測定樣品終濃度稀釋至10 μM。 |
| 2、測定 |
| NanoDrop系列設(shè)備測定設(shè)置： |
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| 一般情況下，對于提取的Oligo DNA/RNA樣品中會(huì)殘留一些在320 nm處有吸收的物質(zhì)（如，核酸類似物、多糖等），所以在進(jìn)行測定時(shí)，需要減去A320的值。因此NanoDrop設(shè)備在樣品測定頁面增加了“基線矯正（Baseline Correction）”功能，旨在用來校正因顆粒光散射引起的任何偏移，測得數(shù)據(jù)中減去指定基線校正時(shí)測得的吸光度。但對于化學(xué)合成的有修飾的Oligo DNA/RNA則不需考慮該影響，其本身在260 nm以外的波長下也會(huì)有吸收，所以不能進(jìn)行校正。在測定時(shí)，不論樣品是否有修飾，選擇“單鏈DNA”模式，不勾選“基線校正”功能，能夠獲得偏差較小的A260數(shù)值。 |
| 3、計(jì)算 |
| 通過設(shè)備直接測定的A260值來計(jì)算測定樣品濃度，計(jì)算公式如下： Primer摩爾濃度μM = 實(shí)測A260值×稀釋倍數(shù)×106/ 摩爾消光系數(shù)ε Probe摩爾濃度μM = 實(shí)測A260值×10注1×稀釋倍數(shù)×106/摩爾消光系數(shù)ε 注1：使用NanoDrop2000/2000c設(shè)備Micro Array模式測定時(shí)，計(jì)算時(shí)需要乘以10（1 cm光程）；使用NanoDrop One設(shè)備測定時(shí)，則不需要乘以10。 |
| NanoDrop設(shè)備在測定A260的同時(shí)會(huì)提供質(zhì)量濃度值，該值是通過“C = A260 ×平均質(zhì)量”計(jì)算得到。在前面平均質(zhì)量說明中，已詳細(xì)說明了該參數(shù)的偏差，所以不建議使用質(zhì)量濃度來計(jì)算。 |
| 除了準(zhǔn)確的定量方法，產(chǎn)品分裝、干燥等環(huán)節(jié)的嚴(yán)格驗(yàn)證，人員的定期培訓(xùn)，設(shè)備的定期校正，Takara多方面確保將合格的產(chǎn)品送到您手中。 |
| 實(shí)驗(yàn)的成功依靠很多方面，一個(gè)小小的細(xì)節(jié)可能就決定了成敗，Takara公司不僅僅注重生產(chǎn)制造的各個(gè)環(huán)節(jié)，對于產(chǎn)品使用的細(xì)節(jié)也能提供有效的解決方案，為您的實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)制造保駕護(hù)航。 |
頁面更新：2023-11-02 10:35:36
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