沒(méi)有問(wèn)題。附帶的緩沖液是進(jìn)行活性測(cè)定的緩沖液，選擇了與原來(lái)的基本緩沖液組份相近的緩沖液，未必是活性最高的緩沖液。使用附帶的緩沖液以外的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，也是沒(méi)有問(wèn)題的，但數(shù)字上加（）的緩沖液，是易受Star活性等影響的緩沖液，應(yīng)避免使用。
為了方便實(shí)驗(yàn)操作，Takara采用了通用緩沖液（Universal Buffer）的限制酶活性表示方法，同時(shí)也滿足雙酶切反應(yīng)（Double Digestion）的要求。本公司的限制酶盡可能地配備Universal Buffer。例如：L、M、H Buffer等。對(duì)一些常用的限制酶，還對(duì)同步雙酶切反應(yīng)條件作了嚴(yán)格的研討，其結(jié)果見Double Digestion（雙酶切反應(yīng)）時(shí)Universal Buffer（通用緩沖液）的使用表，請(qǐng)參考使用。而對(duì)一些在5種Universal Buffer中相對(duì)活性都不太高的限制酶，附帶其Basal Buffer。但請(qǐng)注意，因?yàn)锽asal Buffer為各種限制酶的最適Buffer，其組成也根據(jù)酶種類的不同而不一樣。
可以考慮以下幾種情況：
■ 1. 底物DNA上沒(méi)有該限制酶的識(shí)別、切斷位點(diǎn)。特別是一些經(jīng)過(guò)重組等處理的DNA，堿基易發(fā)生缺失、變化等。
■ 2. 限制酶識(shí)別位點(diǎn)上的A或C被甲基化。部分限制酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)中的堿基是否被甲基化比較敏感，從而無(wú)法切斷該位點(diǎn)。有關(guān)甲基化對(duì)限制酶的酶切反應(yīng)的影響，請(qǐng)參考甲基化對(duì)限制酶活性影響的表格，其中做了詳細(xì)說(shuō)明。
■ 3. 底物不純。如果底物DNA中含有限制酶阻害物質(zhì)，會(huì)影響限制酶的酶切作用。在此種情況下，底物DNA須重新進(jìn)行純化。
■ 4. 限制酶的識(shí)別、切斷位點(diǎn)在底物DNA的高級(jí)構(gòu)造中所處的位置，對(duì)酶切反應(yīng)也有一定的影響。
■ 5. PCR引物的酶切位點(diǎn)前沒(méi)有保護(hù)堿基或引物合成有誤，致使沒(méi)有正確的酶切位點(diǎn)存在。PCR產(chǎn)物酶切前盡量進(jìn)行精制以更換Buffer，避免PCR產(chǎn)物中帶入的其它物質(zhì)影響酶切反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，通常PCR產(chǎn)物的添加量占總反應(yīng)體積25%以下沒(méi)有問(wèn)題。
■ 6. 不同公司的酶和Buffer不要交叉使用，否則可能會(huì)影響酶切效果。
不稀釋為好，Takara的限制酶都根據(jù)最佳反應(yīng)體系配制了濃度。酶制品稀釋時(shí)，酶濃度和活性之間不呈直線對(duì)應(yīng)關(guān)系，酶濃度越稀，相對(duì)活性越低，并且越不穩(wěn)定，有時(shí)便會(huì)出現(xiàn)底物DNA不能切斷之現(xiàn)象。
一般情況下，從大多數(shù)的大腸桿菌中提取的DNA，幾乎都存在被甲基化的現(xiàn)象，其相對(duì)應(yīng)識(shí)別序列的受甲基化影響的限制酶即切不開該酶切位點(diǎn)。而只有在轉(zhuǎn)化時(shí)選用了甲基化酶欠損的大腸桿菌作為宿主，提取的DNA才不會(huì)被甲基化。在實(shí)際操作中，如果使用受甲基化酶影響的限制酶對(duì)從一般的大腸桿菌中提取的DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，而沒(méi)切開，或者對(duì)測(cè)序結(jié)果有酶切位點(diǎn)的片段，切不開，其酶切位點(diǎn)被甲基化的可能性就比較大，這時(shí)就要選用不受甲基化影響的限制酶進(jìn)行酶切。
一種方法是，選用不受dam、dcm甲基化影響的限制酶進(jìn)行酶切反應(yīng)。例如Sau3A I、Mbo I具有相同的酶切位點(diǎn)，但Mbo I受dam methylase的影響，而Sau3A I不受dam methylase的影響。另外一種方法是，使用dam、dcm甲基化酶欠損的宿主菌（例如GM33、JM110）進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)化和制備。還可以使用PCR方法對(duì)該DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行酶切。
由于底物DNA的不同，其含有的酶切位點(diǎn)的摩爾濃度不同，空間結(jié)構(gòu)也不相同，這些，都會(huì)對(duì)酶切反應(yīng)的速度產(chǎn)生影響，所以，相同的酶量，不一定能將不同的底物切開。
各種限制酶，所需要的酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基的數(shù)量不同。一般情況下，在酶切位點(diǎn)以外多出3個(gè)堿基，即可以滿足幾乎所有限制酶的酶切要求。
通常情況下，來(lái)自于哺乳類生物的基因組DNA中的CG序列，被CG methylase甲基化，形成5mCG。另外，由于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中被普遍使用的大腸桿菌（JM109、HB101等）幾乎都含有dam methylase和dcm methylase，從這些宿主中提取的質(zhì)粒DNA的GATC、CCWGG序列被甲基化，分別形成G6mATC、C5mCWGG。受甲基化影響的限制酶切不斷其識(shí)別序列中被甲基化的DNA。所以，用于反應(yīng)的DNA，會(huì)因?yàn)閬?lái)源不同而出現(xiàn)切不開的現(xiàn)象。因此，在反應(yīng)之前，一定要對(duì)DNA被甲基化的情況和所使用的限制酶受甲基化影響情況進(jìn)行確認(rèn)。
限制酶名稱（）里記載的是該限制酶的同裂酶（Isoschizomer）。具有相同的識(shí)別序列的限制酶互稱為同裂酶。Sau3A I和Mbo I是具有相同識(shí)別序列和切斷位置的同裂酶，Mbo I由于受dam methylase的影響，不能夠切斷來(lái)自于一般大腸桿菌的DNA。而Sau3A I不受dam methylase的影響，可以切斷一般大腸桿菌由來(lái)的DNA。有些同裂酶切斷位置不一樣，即雖然識(shí)別序列一樣，但切斷位置不同，使用時(shí)必須注意。另外，即使是切斷位置相同的同裂酶，其受甲基化的影響情況有時(shí)也不一樣。
請(qǐng)參看《Double Digestion（雙酶切反應(yīng)）時(shí)的Universal Buffer（通用緩沖液）的使用 表》，選擇雙酶切反應(yīng)時(shí)的通用緩沖液。Takara公司從1979年開始生產(chǎn)限制酶以來(lái)，做了大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，也積累了很多經(jīng)驗(yàn)，同步雙酶切通用緩沖液表格中所推薦的雙酶切Buffer完全是依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的。Takara公司為了方便限制酶的統(tǒng)一使用，采用了通用緩沖液（Universal Buffer）系統(tǒng)，并列出了各種限制酶在各種通用緩沖液中的相對(duì)活性。如果兩種酶在《Double Digestion（雙酶切反應(yīng)）時(shí)的Universal Buffer（通用緩沖液）的使用表》中沒(méi)有找到同步雙酶切的通用緩沖液，我們可以在《用Universal Buffer和Basal Buffer進(jìn)行限制酶活性表示》表中挑選一種通用緩沖液進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其條件是：兩種酶在這種通用緩沖液中的相對(duì)活性都比較高（60%以上）。如果沒(méi)有找到同步雙酶切的通用緩沖液，通常要進(jìn)行分步酶切，即先做一種酶切，乙醇沉淀純化后，再做另一種酶切反應(yīng)。
底物DNA或酶切試劑中混有DNase，在一定的溫度或緩沖液的作用下，激發(fā)DNase發(fā)揮作用，將底物DNA降解?？梢允褂闷渌拗泼该盖械孜顳NA，也可以使用此酶切其他底物DNA，來(lái)驗(yàn)證酶和底物DNA是否有問(wèn)題。如果質(zhì)粒酶切出現(xiàn)此情況，首先將質(zhì)粒做乙醇沉淀再酶切。
乙醇沉淀的方法如下：
■ 1. 加入1/10體積的3 M CH3COONa（pH5.2），混勻。
■ 2. 加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置30～60分鐘。
■ 3. 12,000 rpm，4℃離心10 min，回收沉淀。
■ 4. 用1 ml 70%的預(yù)冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃離心10 min，除去上清，真空或室溫干燥沉淀，注意不要干燥過(guò)度。
■ 5. 沉淀用滅菌蒸餾水或TE溶解，進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。
簡(jiǎn)并堿基的種類表示如下：
M：A or C R：A or C S：C or G
K：G or T Y：C or T????????????H：A or C or T
N：A or C or G or T? W：A or T D：A or G or T
以上的純化方式都可以對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切膠回收的損失比較大。分步酶切的中間產(chǎn)物可以使用乙醇沉淀和片段回收試劑盒（在允許純化的片段長(zhǎng)度范圍內(nèi)使用）進(jìn)行純化，這樣操作可以減少損失。
① 引起Star活性的原因：
■ 1. 較高的甘油濃度（>5% v/v）。
■ 2. 酶與底物DNA比例過(guò)高（不同的酶情況不同，通常為>100 U/μg）。
■ 3. 低鹽濃度（<25 mM）。
■ 4. 高pH值（pH>8.0）。
■ 5. 存在有機(jī)溶劑（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）。
■ 6. 用其他二價(jià)離子替代鎂離子（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。
Star活性是內(nèi)切酶的一種普遍現(xiàn)象，但是大多數(shù)可以控制，正常情況下使用寶生物提供的緩沖液就不會(huì)出現(xiàn)Star活性。
② 抑制Star活性的方法：
■ 1. 盡量使用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過(guò)度消化以及過(guò)高的甘油濃度。
■ 2. 盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時(shí)引入的乙醇）的污染。
■ 3. 將離子濃度提高到100～150 mM（若酶活性不受離子強(qiáng)度影響）。
■ 4. 將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。
■ 5. 二價(jià)離子使用Mg2+。
通常使用高濃度限制酶酶切g(shù)DNA等高濃度DNA樣品，這樣可以避免在反應(yīng)液中加入過(guò)量的甘油，從而有效防止Star活性產(chǎn)生。此外，對(duì)于需要大量酶的脈沖場(chǎng)電泳，使用高濃度限制酶更方便。但需要注意，當(dāng)反應(yīng)液中底物DNA濃度較低時(shí)，加入適當(dāng)活性單位的高濃度限制酶，操作會(huì)很困難，這種情況下推薦使用普通濃度的限制酶制品。 兩種濃度限制酶在保存穩(wěn)定性上是一致的。
每種限制酶、DNA底物的標(biāo)準(zhǔn)使用量，請(qǐng)參考說(shuō)明書中“一般反應(yīng)體系”內(nèi)容。
限制酶的活性單位是按照反應(yīng)1小時(shí)定義的，通常建議反應(yīng)時(shí)間從1小時(shí)至幾小時(shí)。反應(yīng)中使用的標(biāo)準(zhǔn)酶量是反應(yīng)體系的1/20體積量。如果要增加酶的使用量，請(qǐng)控制在反應(yīng)體系的1/10體積量以下。限制酶溶液中的甘油如果過(guò)量（5%以上）引入到反應(yīng)液中，會(huì)影響限制酶識(shí)別DNA序列，從而導(dǎo)致不正確的序列識(shí)別，產(chǎn)生非特異性酶切。如果使用的酶量(U)相對(duì)于DNA底物不足，則需要更長(zhǎng)的酶切反應(yīng)時(shí)間。另外，限制酶的活性受到識(shí)別位點(diǎn)前后序列的影響，酶切難易程度不同。
限制酶反應(yīng)后立即進(jìn)行電泳時(shí)，只需添加10×Loading Buffer，不需要進(jìn)行限制酶的失活處理。但是，限制酶中有穩(wěn)定性高的酶，如果直接進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)殘留的酶活性可能會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響。很多限制酶可以通過(guò)加熱失活，但是有的酶經(jīng)70°C加熱處理也不能完全失活。對(duì)于這樣的酶，請(qǐng)使用苯酚進(jìn)行完全失活處理。關(guān)于失活處理后殘存活性的數(shù)據(jù)，請(qǐng)參考以下網(wǎng)站內(nèi)容。
各種失活處理后限制酶的殘存活性
酶切反應(yīng)中，Mg離子是必需的。過(guò)量的EDTA會(huì)螯合反應(yīng)液中的金屬離子，阻礙酶切反應(yīng)。核酸制備一般含有1 mM的EDTA。反應(yīng)液中加入1/10左右體積量的DNA底物時(shí)，對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響。
可以使用能夠切斷腺嘌呤甲基化GmA↓TC的Dpn I (Code No. 1235A/B)。該酶能切斷甲基化的GmATC，但不能切斷未被甲基化的GATC。該酶能夠切斷來(lái)源于常用大腸桿菌(dam+)的DNA，不能切斷PCR產(chǎn)物，因此可用于去除PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板。
QuickCut限制酶不建議與普通限制酶同時(shí)使用，進(jìn)行同步雙酶切。如果需要進(jìn)行雙酶切，可以考慮分步酶切，一種酶切結(jié)束后經(jīng)過(guò)乙醇沉淀再使用另一種酶進(jìn)行酶切。
普通限制酶不建議搭配QuickCut Buffer使用。
使用QuickCut限制酶進(jìn)行雙酶切時(shí)，兩種酶的總加量不超過(guò)反應(yīng)體系的1/10。
如果各酶的反應(yīng)溫度不同，建議按低溫到高溫的順序加入相應(yīng)的QuickCut限制酶進(jìn)行分步酶切反應(yīng)。
QuickCut限制酶酶切時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。如果需要延長(zhǎng)酶切時(shí)間，建議時(shí)間不要超過(guò)“不產(chǎn)生Star Activity的時(shí)間”，具體信息可以參考制品說(shuō)明書。
不建議縮小酶切反應(yīng)體系，酶切體系過(guò)小可能會(huì)影響酶切效果。
頁(yè)面更新：2019-12-09 16:09:06
|
使用規(guī)章丨聯(lián)系方式丨 關(guān)于個(gè)人信息的保護(hù)丨特別說(shuō)明
寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司
Copyright ? 2015 Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. All rights reserved. 京ICP備06030419號(hào)-1
京公網(wǎng)安備 110114000405號(hào)
