在這種情況下最好先進行乙醇沉淀，再用滅菌蒸餾水或TE Buffer溶解DNA，這樣做可以消除限制酶酶切反應液中的限制酶及鹽離子對連接反應所造成的影響。
可以從以下幾個方面進行改進：
1. 連接的片段最好切膠回收純化。
2. 目的片段與載體的摩爾比例為3～10：1。
3. 對于結構特殊的DNA，可以將DNA溶液60～65℃保溫5～10分鐘后急冷再連接。
4. 延長連接反應時間至過夜。
5. 轉化前，向9 μl 連接液中加入1 μl Solution III 可提高轉化效率，，但是此方法不適合電轉化。
6. 使用高效率的感受態(tài)細胞進行轉化。
如果反應溫度升高（＞26℃），較難形成環(huán)狀DNA。因此連接反應建議于16℃進行。
1. 延長連接反應時間至過夜。
2. 轉化前，向9 μl連接液中加入1 μl Solution III可提高轉化效率。
3. 粘性末端DNA連接時，將DNA溶液（載體+片段）于60-65℃保溫2-3分鐘后急冷，再加入Solution I進行反應。當上述三種方法均不能提高連接轉化效率時，建議重新純化DNA。
轉化效率會降低。建議先做乙醇沉淀后再做電轉化。Solution III不能用于電穿孔法轉化。
反應方法與A相同。若進行體外包裝，建議使用DNA Ligation Kit Ver.1 (Code No. 6021)。
建議先將酶切反應液做乙醇沉淀處理，再重懸于適宜的緩沖液中，然后使用本試劑盒做連接反應。同樣，如果在連接后做酶切反應，也需要先將反應液做乙醇沉淀處理，再重懸于適宜的緩沖液中，然后進行酶切反應。
可以。直接向連接反應液中加入鹽溶液（終濃度為150 mM NaCl, 2 M CH3COONH4 或 300 mM CH3COONa），再進行乙醇沉淀處理。
不適用。DNA Ligation Kit ﹤Mighty Mix﹥ Ver.2.1 (Code No. 6022)適用于等體積Solution I和DNA溶液混合的小體系連接反應。由于反應受DNA溶液組成的影響，所以使用DNA Blunting Kit (Code No. 6025)的溶液A和溶液B代替DNA Ligation Kit ﹤Mighty Mix﹥ Ver.2.1 (Code No. 6022)會導致連接反應失敗。如果在使用DNA Blunting Kit之后使用DNA Ligation Kit ﹤Mighty Mix﹥ Ver.2.1，則需將DNA溶液先進行苯酚處理，再做乙醇沉淀后使用。
如果DNA片段是使用商品化的提取產品或試劑（如柱子或硅膠）回收的，那么使用本試劑盒進行連接反應，效率可能較低。因此，在使用本試劑盒前，需將回收的DNA片段做乙醇沉淀處理，再重懸于適宜的緩沖液（如TE）中，以確保較高的連接效率。
最適量為1～2 μg。例如，對于線型pUC18 DNA（2686 bp）來說大約為0.1～10 μg（根據DNA 5’末端濃度換算約0.1～10 pmol）。
限制酶酶切片段經末端平滑（Blunting）處理后，其5’端帶有磷酸基，克隆時最好使用去磷酸化載體，以防止載體的自身連接。
對于PCR擴增產物，除非是使用了5’磷酸化的引物做PCR反應，否則PCR片段的5’端不帶有磷酸基。因此克隆PCR產物時不要將載體去磷酸化。此時若與去磷酸化載體連接時則必須使用T4 PNK將PCR產物的5’末端磷酸化。利用DNA Blunting Kit進行平滑反應后，用苯酚抽提法可將酶完全除去，然后用T4 PNK進行5’末端磷酸化反應，再在65℃條件下加熱10分鐘使酶完全失活。此反應液可以直接用于連接反應。
與具有突出末端的DNA相比，平滑末端DNA的連接效率相對較低。當延長連接反應時間甚至過夜反應也不能改善連接轉化效率時，可向反應后的連接液中加NaCl使其終濃度為500 mM，再做細菌轉化，轉化效率可能會有所提高。
不可以。使用DNA Blunting Kit可以使具有去磷酸的5’突出末端的DNA末端平滑，但不能使具有磷酸化的3’凹陷末端的DNA末端平滑。在鳥槍法克隆時，應注意超聲波分解的DNA片段可能會具有磷酸化的3’凹陷末端。
使用DNA Ligation Kit LONG時需要注意如下事項：
1. Vector DNA與長鏈Insert DNA的制備。
1) 由于DNA損傷可能會導致連接效率低下，所以在制備Vector DNA與Insert DNA時，要盡量減少UV的照射時間。
2) 若想實現高效克隆，盡量使用粘性末端進行連接，它比平滑末端的連接效率高10-100倍。
2．PCR產物的克隆。
1) 含有3’A末端的長鏈PCR產物克隆時，一般不推薦使用TA克隆法。如果需要克隆此類PCR產物，先使用T4 DNA Polymerase將片段的末端平滑化，再與平末端的載體連接。
2) PCR產物電泳成像時有時盡管只觀察到特異性條帶，但產物中還是會含有電泳成像時不能分辨到很多非特異性條帶，所以我們推薦使用凝膠電泳切膠回收的方法純化PCR產物。
3) 由于具有3’→5’核酸外切酶活性，使用高保真的DNA Polymerase（如PrimeSTAR® HS DNA Polymerase等）擴增得到的PCR產物末端為沒有磷酸化的平滑末端。所以在進行連接反應前，應使用T4 Polynucleotide Kinase進行5’末端磷酸化，或者在進行PCR反應時，直接使用磷酸化Primer進行PCR擴增反應。
3．Vector DNA與Insert DNA摩爾比。
當Vector DNA/Insert DNA摩爾比低于1:1時，連接效率將會降低；另一方面，當Insert DNA量高時，陽性克隆比率高。Vector DNA/Insert DNA摩爾比和濃度對連接效率影響很大，是很重要的因素。高濃度的載體DNA能夠提高重組子總數，但克隆效率會降低。
粘性末端：
連接反應液中Vector DNA（2 kb～10 kb）的濃度在0.5 ng～1 ng/μl時效率最佳，濃度高時形成的菌落多，但每微克Vector DNA的克隆效率會降低。
Vector DNA/Insert DNA摩爾比根據Insert DNA長度不同而不同，一般推薦的最適條件為：2 ：1～10 ：1。
平滑末端：
連接反應液中Vector DNA（2 kb-10 kb）的濃度在1 ng-2 ng/μl時效率理想，適宜的Vector DNA/Insert DNA摩爾比為1:2-10:1。
4. 連接時間。
粘性末端連接請在16℃保溫3-15小時（圖1）；平滑末端連接緩慢，請在16℃保溫至少15小時。
如下圖所示。
Ligation Time |
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| 圖1. 粘性末端連接的時間曲線 | ||
| 將18 kb Insert DNA/Hind III與pUC118/HindIII/BAP按標準方法進行連接，連接產物化學轉化感受態(tài)細胞，在LB-amp平板37℃培養(yǎng)過夜。計數平板上的菌落數，每個時間點的菌落數比率如圖顯示，以15小時時出現的菌落數比率為100％計算。 | ||
Ligation Time |
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| 圖1. 平滑末端連接的時間曲線 | ||
| 將18 kb Insert DNA/Sma I與pUC118/Hinc II/BAP按標準方法進行連接，連接產物化學轉化感受態(tài)細胞，在LB-amp平板37℃培養(yǎng)過夜。計數平板上的菌落數，每個時間點的菌落數比率如圖顯示，以15小時時出現的菌落數比率為100％計算。 | ||
5．電穿孔法轉化。
1) 通?；瘜W轉化法可以轉化約20 kb以下的連接產物，而電穿孔轉化法效率很高，可以轉化20 kb以上的長鏈DNA連接產物甚至是文庫。
2) 本實驗的連接反應液不能直接進行電穿孔法轉化，可用乙醇沉淀法或者透析法（參照6.DropDialysis法置換Buffer）等對連接液進行Buffer置換。置換Buffer請使用滅菌水或者TE Buffer。要提高轉化效率時，推薦使用透析法置換Buffer，不要使用苯酚/氯仿分離，防止長鏈連接產物斷裂。
3) E. coli有限制外源DNA的機制，例如hsdRMS編碼的EcoK I限制系統(tǒng)，mcrA 、mcrB、 mcrC hsdRMS、mcr、mrr編碼的甲基化的限制系統(tǒng)。這些系統(tǒng)對外源DNA特別是長鏈DNA的克隆有影響，會導致克隆轉化效率大幅下降，目的DNA難以克隆。為了避免這種現象，建議使用相關基因缺失的大腸桿菌（如HST08等）進行長鏈DNA的轉化。
E. coli HST08 Premium Competent Cells（Code No. 9128）
E. coli HST08 Premium Electro-Cells（Code No. 9028）
HST08基因型：
F-，endA1，supE44，thi-1，recA1，relA1，gyrA96，phoA，φ80dlacZ ΔM15，Δ(lacZYA-argF) U169，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC )，ΔmcrA，λ-
6．DropDialysis法置換Buffer（用于電穿孔法轉化）。
1) 將培養(yǎng)皿（直徑120 mm）置于冰中，加入10倍稀釋的TE Buffer(1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA,pH8.0) 25 ml。
2) 將Millipore 0.025 μM TypeVS membrane漂浮于（1）的1/10 TE Buffer上。
3) 使用切掉尖端的Tip將連接液慢慢輕柔地滴于（2）的Type VS membrane上。
4) 蓋上皿蓋，于冰上透析3小時，每隔30 min-1 h輕柔攪拌1/10 TE buffer。
5) 使用切掉尖端的Tip小心回收透析DNA，并轉移至微量離心管中。
6) 取1-10 μl連接液加入E.coli Eletro Cells中進行電轉化。
1. 延長連接反應時間至過夜。
2. 平滑末端載體的連接反應時，DNA溶液的鹽濃度過高，會降低連接轉化效率。平滑末端載體連接時，盡量將DNA溶液中的鹽除去。
3. 粘性末端的DNA連接反應時，將DNA溶液（載體+插入DNA片段）于60～65℃保溫2～3分鐘后急冷，再加入Ligation Mix后進行連接反應。確保粘性末端的DNA連接可改善轉化效率。
轉化效率會降低，不可直接用于電穿孔法轉化。建議乙醇沉淀置換Buffer后再進行電穿孔法轉化。
Cosmid用于感受態(tài)細胞轉化時，請按照說明書操作方法中「1. 向質粒載體中插入外源DNA」的方法進行操作。
Cosmid用于體外包裝時，請按照說明書操作方法中「5. 向λPhage Vector中插入外源DNA」的方法進行操作。
建議先將酶切反應液進行乙醇沉淀處理，再溶解于TE Buffer中。如果在連接后做酶切反應，也需將反應液做乙醇處理后再進行酶切反應。
可以。直接向連接反應液中加入鹽溶液（NaCl終濃度150 mM，CH3COONH4終濃度2 M，CH3COONa終濃度300 mM）后再進行乙醇沉淀處理。
不可以。DNA Ligation Kit ﹤Mighty Mix﹥（Code No. 6025）中的Ligation Solution A和Ligation Solution B與DNA Ligation Kit Ver. 1的組份相同。DNA Ligation Kit ﹤Mighty Mix﹥
如果使用商品化的DNA提取試劑盒，從柱子或硅膠回收的DNA提取液直接進行連接反應時，連接效率可能會降低。這時，可以將DNA提取液進行乙醇沉淀，溶解于TE Buffer后再進行連接反應。
頁面更新：2020-04-26 14:49:35
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