&

機構(gòu)用戶解決方案

當(dāng)前位置：首頁 > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問答 > Takara > cDNA合成 & 克隆 > 修飾酶-反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑

Q-1：各種Reverse Transcriptase的區(qū)別?

A-1：

各種Reverse Transcriptase的區(qū)別如下:

		Reverse Transcriptase PrimeScript^™	Reverse Transcriptase (M-MLV)	Reverse Transcriptase (AMV)
活性	DNA Polymerase 5’→3’ Exonuclease dsDNA 5’→3’ ssDNA 3’→5’ dsDNA 3’→5 RNase H	+ - - - -	+ - - - -	+ - - - +
模板	Single-Stranded DNA Single-Stranded RNA	+ ++	+ ++	+ ++
分子量最適pH 金屬離子 Processivity Elongation速度 ddNTP的滲入 Vortex的影響		77,000 8.3 Mg²⁺ 數(shù)百堿基 n.i. n.i. 不太穩(wěn)定	71,000 8.3 Mg²⁺ 數(shù)百堿基 n.i. n.i. 不太穩(wěn)定	αβ157,000 8.3 Mg²⁺ 數(shù)百堿基 4堿基/s 高不太穩(wěn)定

Q-2：合成不了長鏈cDNA的原因是什么?: A-2：
合成不了長鏈cDNA的原因如下：
1. RNase的原因（cDNA的電泳譜帶出現(xiàn)模糊）。
對使用的器具、試劑請盡可能干熱或者濕熱滅菌處理。同時，在反應(yīng)時請加入Recombinant RNase Inhibitor。
2. 反應(yīng)條件不適合（cDNA的合成量少）。
請通過預(yù)備實驗探討適合的反應(yīng)條件，此時所要研討的項目包括：酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度（37～65℃）、DTT濃度（0.5～10 mM）。
3. RNA結(jié)構(gòu)上的問題（出現(xiàn)低分子帶）。嘗試提高反應(yīng)溫度，請使用隨機引物。

Q-3：使用Recombinant RNase Inhibitor要注意哪些問題?: A-3：
使用Recombinant RNase Inhibitor要注意以下問題：
1. 抑制活性的pH值范圍較廣，在pH7～8時表現(xiàn)最大活性。
2. 不要稀釋使用。蛋白濃度過低易失活，而攪拌更易失活，因此建議盡量使用原液填加到反應(yīng)體系中。
3. 起泡或強烈攪拌（Vortex等）會引起失活。
4. 不抑制RNase H活性。

Q-4：如何使用Recombinant RNase Inhibitor?

A-4：

使用例
cDNA第一條鏈的合成。
1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量為20 μl。

模板RNA	1	μg
5 × Reverse Transcriptase XL Buffer*	4	μl
dNTP Mixture（10 mM each）	2	μl
Oligo(dT)18 Primer或Random Primer（6-9 mer）	50	pmol
Recombinant RNase Inhibitor	20	U
AMV Rtase	5	U
DEPC H2O	Up to 20	μl
* AMV（Code No. 2621）制品中附有。

2. 輕輕攪拌。
3. 室溫下10分鐘放置后，移入42℃恒溫槽中。
4. 42℃保溫1小時。
5. 把樣品移入冰中冷卻2分鐘。
（得到的反應(yīng)液可用于cDNA第二條鏈的合成。）

頁面更新：2020-04-27 10:40:10