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Q-1：各種Nuclease的特性比較?

A-1：

各種Nuclease的特性比較列表如下：
Endonuclease（核酸內(nèi)切酶）種類：
S1 Nuclease，Mung Bean Nuclease，BAL 31 Nuclease（單鏈），Micrococcal Nuclease，Deoxyribonuclease I，Ribonuclease H
Exonuclease（核酸外切酶）種類：
Exonuclease I，Exonuclease III，BAL 31 Nuclease（雙鏈）

	S1 Nuclease	Mung Bean Nuclease	Exonuclease I	Exonuclease III
反應(yīng)特異性	Endonuclease ssDNA，ssRNA	Endonuclease ssDNA，ssRNA	Exonuclease 3’→5’ssDNA	Exonuclease 3’→5’dsDNA
最終生成物	5’-P Mononucleotide 5’-P Oligonucleotide	5’-P Mononucleotide 5’-P Oligonucleotide	5’-P Mononucleotide	ssDNA 5’-P Mononucleotide
分子量	32,000	39,000	52,140	28,000
最適pH	4.5	5.0	9.5	8.0
金屬離子	Zn²⁺	Zn²⁺	Mg²⁺	Mg²⁺

	BAL 31 Nuclease	Deoxyribonuclease I	Micrococcal Nuclease	Ribonuclease H
反應(yīng)特異性	Endonuclease ssDNA Exonuclease 5’→3’ 3’ →5’dsDNA	Endonuclease ssDNA，dsRNA	Exonuclease ssDNA，dsDNA，ssRNA	RNA-DNA Hybrid特異的Endonuclease
最終生成物	5’-P Mononucleotide	5’-P Oligonucleotide	3’-P Mononucleotide 3’-P Oligonucleotide	ssDNA 5’-P Oligonucleotide
分子量	73,000～83,000	31,000	16,800	21,000
最適pH	8.1	7.0	9.2	8.0
金屬離子	Ca²⁺，Mg²⁺	Ca²⁺，Mg²⁺	Ca²⁺	Mg²⁺，Mn²⁺

Q-2：各種核酸酶的使用注意事項(xiàng)?

A-2：

各種核酸酶的使用注意事項(xiàng)如下：
1. Mung Bean Nuclease：
雙鏈識(shí)別能力依賴于堿基序列，切點(diǎn)多為A↓pN及T（U）↓pN，特別是在A↓pN處完全分解，而對(duì)G及C的序列幾乎不分解。
與S1 Nuclease不同，不能切斷切口對(duì)側(cè)的鏈。
2. BAL 31 Nuclease：
請(qǐng)通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)探討適合的反應(yīng)條件，此時(shí)所要研討的項(xiàng)目包括：酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度（37～65℃）、DTT濃度（0.5～10 mM）。
a. 單鏈Endonuclease活性在反應(yīng)溫度從30℃降到20℃時(shí)，大約下降到1/10左右，而雙鏈Exonuclease活性大約殘留1/3左右。
b. Endonuclease活性不受鹽濃度影響，但Exonuclease則是鹽濃度越高活性越低。
c. Trimming活性的最適鹽濃度為NaCl 200 mM左右，若低于此濃度有時(shí)表現(xiàn)Nicking活性。
d. 分解活性對(duì)堿基的依存性較高，由于GC rich領(lǐng)域（特別是Sma I site）不易被分解，在酶切時(shí)，有必要選擇末端限制酶位點(diǎn)。
e. 反應(yīng)中因各種酶活性的反應(yīng)分配（Distributive）關(guān)系，對(duì)酶濃度有較大的依存，所以對(duì)稀釋不表現(xiàn)線性關(guān)系。當(dāng)酶反應(yīng)速度過快時(shí)，與其降低酶量，不如降低反應(yīng)溫度。
f. 本酶需要Ca²⁺的存在，通過使用螯合劑可使其不可逆失活。在NaCl濃度為1 M左右時(shí)，該酶對(duì)于單鏈DNA表現(xiàn)出最大活性。相反對(duì)于雙鏈DNA，其活性則隨著鹽濃度的增加而降低。當(dāng)鹽濃度在100 mM以下時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生隨機(jī)分解。因此，建議在鹽濃度200～600 mM的范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。
g. 通過本酶產(chǎn)生的末端的平滑率只有10%左右，為了提高連接效率，建議通過T4 DNA Polymerase進(jìn)行修復(fù)。
3. Exonuclease III：
a. 反應(yīng)在37℃時(shí)受各種活性的分配影響（Distributive），但在23℃時(shí)，如果酶量充分，基本上能以一定的速度分解。
b. 該酶在性質(zhì)上有這樣一個(gè)特點(diǎn)：DNA即使具有3’突出末端，有時(shí)也因其末端及序列的不同而被作為底物降解。例如：
一個(gè)堿基突出型（Eam1105 I等）
二個(gè)堿基突出型（Pvu I、Sac II等）
三個(gè)堿基突出型（Sfi I等）
四個(gè)堿基突出型（Apa I被確認(rèn)，Ban II及BstX I也有可能）
4. Micrococcal Nuclease：
本酶的活性嚴(yán)格依賴于Ca²⁺的存在，用EDTA或EGTA可以終止反應(yīng)。
5. Deoxyribonuclease I：
a. 本酶最適pH值為中性附近，穩(wěn)定pH值為5～6。
b. 80℃、10分鐘熱處理后，可使其不可逆失活。

Q-3：末端平滑時(shí)S1 Nuclease與Mung Bean Nuclease的區(qū)別?

A-3：

一般認(rèn)為，末端為GC時(shí)Mung Bean Nuclease易發(fā)生堿基殘留，而S1與之相反易發(fā)生切入（Nibbling）現(xiàn)象，根據(jù)DNA末端的不同而區(qū)分使用為宜（末端富含GC時(shí)使用S1，但應(yīng)注意反應(yīng)時(shí)間，不要發(fā)生切入現(xiàn)象。除此之外使用MB）。但不管哪種酶，在反應(yīng)后用T4 DNA Polymerase處理后，DNA末端平滑的效率都會(huì)提高。

Q-4：Mung Bean Nuclease作用后DNA電泳條帶模糊，是切入（Nibbing）了嗎?

A-4：

Mung Bean Nuclease基本上不發(fā)生切入現(xiàn)象。請(qǐng)?jiān)?0～50 U/μg DNA，25℃，15min的條件下進(jìn)行反應(yīng)。在30 U，37℃，10 min以上的條件下有時(shí)可能會(huì)發(fā)生非特異性分解。另外，在用Mung Bean Nuclease處理DNA之前使用Exo III時(shí)，在DNA上如有切口，Exo III將從切口處作用。因此，需要確認(rèn)是否是無切口的完好的DNA。

Q-5：在BAL 31 Nuclease的反應(yīng)液中，加入了600 mM的高濃度NaCl，對(duì)反應(yīng)有沒有影響?

A-5：

由于BAL 31 Nuclease是海洋細(xì)菌由來的酶，即使在高鹽濃度下也能充分地顯示活性。分別在60 mM、200 mM、600 mM NaCl下比較Exonuclesae活性，幾乎沒有差別。60 mM與600 mM相比，也只是在60 mM條件下的酶活性高2～3倍左右。由于在60 mM NaCl條件下，容易因Nicking活性而發(fā)生鏈內(nèi)裂解，因此，不適于使用低鹽濃度。而在600 mM NaCl條件下分解速度適當(dāng)，在使用上完全沒有問題。

Q-6：BAL 31 Nuclease對(duì)Nick（切口）作用嗎?

A-6：

BAL 31 Nuclease對(duì)Nick（切口）作用，但程度較低。

Q-7：Micrococcal Nuclease的反應(yīng)體系是什么？

A-7：

使用例
DNA的片段化
1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。

DNA	100	μg
10×Micrococcal Nuclease	5	μl
Micrococcal Nuclease	2	U
dH2O	Up to 50	μl

2. 37℃反應(yīng)數(shù)分鐘（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定具體反應(yīng)時(shí)間）。
3. 加入5 μl的200 mM EGTA（或EDTA）停止反應(yīng)。
4. 加入5 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。
5. 加入125 μl（2.5倍量）的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
6. 離心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。

Q-8：只想從末端除去幾個(gè)核苷酸時(shí)，用通常的反應(yīng)條件切過了怎么辦?

A-8：

使用BAL 31 Nuclease時(shí)，降低反應(yīng)溫度（20℃時(shí)大約為30℃時(shí)的1/3活性），或Exonulease III和S1 Nuclease組合使用。

Q-9：Exo III作用于DNA后進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，出現(xiàn)電泳帶模糊，是非特異性的Nuclease污染嗎?

A-9：

Exo III也作用于Nick。用限制酶切斷DNA時(shí)，如果酶過量或使之長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)，由于Star活性有時(shí)會(huì)使DNA產(chǎn)生切口。

Q-10：Recombinant DNase I (RNase-free)的使用注意事項(xiàng)?

A-10：

通常使用Recombinant DNase I (RNase-free)來分解體外轉(zhuǎn)錄后的模板DNA和去除RNA中的基因組DNA，反應(yīng)后都要經(jīng)過苯酚抽提。
Recombinant DNase I (RNase-free)的RNase Free是相對(duì)的，如果不是必要的話，可以不去除RNA中的gDNA，而是通過設(shè)計(jì)引物來避免擴(kuò)增gDNA模板，同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加反轉(zhuǎn)錄酶）來檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果必須去除gDNA，一定要使用RNase Free 的DNase I。

Q-11：使用DNA Topoisomerase I要注意哪些問題?

A-11：

使用DNA Topoisomerase I要注意以下問題：
1. pBR322 DNA和φX174 DNA的RF I（超螺旋分子）用DNA Topoisomerase I反應(yīng)后電泳，膠中含溴乙錠（EtBr）時(shí)，反應(yīng)前后DNA帶的位置不發(fā)生變化。這是因?yàn)橛蒁NA Topoisomerase I作用而轉(zhuǎn)換為松散型的DNA受EtBr的影響，再次變?yōu)槌菪隣顟B(tài)。因此，使用Topoisomerase I反應(yīng)后，一般使用不含EtBr的瓊脂糖凝膠電泳，電泳終了后再用EtBr染色。
2. 如果在10×添附Buffer中直接加入0.1%小牛血清白蛋白溶液，會(huì)產(chǎn)生大量的白色沉淀。因此，在反應(yīng)液調(diào)制時(shí)需按以下順序添加試劑：
dH2O→10×反應(yīng)緩沖液→0.1% BSA→底物DNA

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