技術(shù)原理： |
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| Real Time PCR的定量原理圖 |
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| 閾值和Ct值的相互關(guān)系圖 |
| 決定系數(shù)（r Squared） 反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想值應(yīng)大于0.98，越接近于1說明直線性越好，定量越準(zhǔn)確。 斜率（slope） 反映PCR擴(kuò)增效率，-0.25～-0.33（根據(jù)不同裝置數(shù)值不同）。 擴(kuò)增效率（E） 理想擴(kuò)增效率應(yīng)在0.8﹤E﹤1.2。 |
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| 標(biāo)準(zhǔn)曲線的評價(jià)指標(biāo)圖例 |
| 應(yīng)用進(jìn)展： Real Time PCR是具有劃時(shí)代意義的技術(shù)，具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，不僅應(yīng)用于基因表達(dá)解析，還廣泛應(yīng)用于SNP分型解析、物種鑒定、病毒和病原菌的檢測、轉(zhuǎn)基因食品的定量分析、導(dǎo)入基因拷貝數(shù)的解析等諸多領(lǐng)域。 閾值（threshold）： 在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限。 Ct值（Cycle threshold）： 表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 經(jīng)數(shù)學(xué)理論證明，Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值成反比線性關(guān)系。 |
必須根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)用途進(jìn)行選擇。如果用于區(qū)別同源性高的序列以及進(jìn)行SNP分型解析等多重PCR檢測，熒光探針法無可替代，而進(jìn)行除此之外的Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，我們推薦使用簡單易行、成本低的嵌合熒光嵌合法。 可以參考如下信息：
| 嵌合熒光法 | 探針法 | |
| 優(yōu)點(diǎn) | 簡單易行，成本較低，無需合成特異性探針。 | 特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重PCR。 |
| 缺點(diǎn) | 對擴(kuò)增的特異性要求高；不能進(jìn)行多重PCR。 | 需要設(shè)計(jì)特異性探針，成本較高；有時(shí)探針設(shè)計(jì)困難。 |
探針法通常是使用5’端帶有熒光物質(zhì)（如：FAM等），3’端帶有淬滅物質(zhì)（如：TAMRA、BHQ等）的探針進(jìn)行熒光檢測的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，不能檢出熒光。探針的報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射波長要在淬滅基團(tuán)的吸收波長范圍內(nèi)。
| 淬滅基團(tuán)種類 | 淬滅基團(tuán)性質(zhì) | 使用的報(bào)告基團(tuán)種類 | |
| TAMRA | 熒光物質(zhì) |
FAM,HEX,TET,JOE等 | |
| BHQ系列染料 | BHQ1 | 非熒光物質(zhì) |
FAM,HEX,TET,JOE等 |
| BHQ2 | 非熒光物質(zhì) |
Cy3,TAMRA,ROX,Texas Red,Cy5等 | |
| BHQ3 | 非熒光物質(zhì) |
Cy5等 | |
基因表達(dá)解析等絕大部分RT-PCR，非常適合選擇Two Step RT-PCR，而RNA病毒檢測等以基因檢測為目的RT-PCR，應(yīng)優(yōu)先考慮防止污染，所以建議選擇One Step RT-PCR。
1. 進(jìn)行Two Step RT-PCR反應(yīng)時(shí)，可選擇Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再將一部分反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA）作為模板添加到Real Time PCR反應(yīng)液中。使用反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的反轉(zhuǎn)錄引物，如果選擇Random Primer或Oligo dT Primer，合成的cDNA可用于復(fù)數(shù)種類基因的檢測，cDNA溶液可以穩(wěn)定地長期保存，供以后解析使用。
2. One Step RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡單，污染幾率低。但此時(shí)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)都并非為各自的適宜條件，所以O(shè)ne Step RT-PCR通常比Two Step RT-PCR反應(yīng)效率低。此外，與Two Step RT-PCR反應(yīng)相比，反轉(zhuǎn)錄酶等的使用量多，每個(gè)反應(yīng)的成本相對較高。One Step RT-PCR反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物只能使用基因的特異性PCR下游引物，而不能使用Random Primer或Oligo dT Primer共用引物。
絕對定量與相對定量有如下差別：
1. 絕對定量：是對未知樣品的絕對量（拷貝數(shù)）進(jìn)行測定的方法；通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。
2. 相對定量：是分別測定目的基因和參比基因的量，再求出對于參比基因的目的基因的相對量，最后再進(jìn)行樣品間相對量的比較。主要用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片、siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
熒光定量實(shí)驗(yàn)的成功因素如下：
1. 優(yōu)良試劑的選擇。
Real Time PCR試劑的選擇是否合適，也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)，所以在這里有必要對試劑的選擇要點(diǎn)加以說明。
a. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量直接影響定量的準(zhǔn)確性。建議使用標(biāo)準(zhǔn)品專用稀釋Buffer稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
b. 根據(jù)采用的熒光檢測方法進(jìn)行試劑選擇。選擇探針法專用試劑或嵌合法專用試劑。
c. Real Time RT-PCR要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行試劑選擇。mRNA表達(dá)量分析選擇Two Step RT-PCR試劑，病毒病原菌檢測選擇One Step RT-PCR試劑。
d. Real Time PCR 反應(yīng)通常樣品數(shù)量較多，操作步驟過多易產(chǎn)生錯(cuò)誤。最好選擇PCR反應(yīng)用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等試劑已經(jīng)預(yù)混在一起的2×Premix Type試劑，操作更加簡單方便。同時(shí)，使用的試劑最好不需要在進(jìn)行Mg2＋濃度的優(yōu)化等實(shí)驗(yàn)。
e. Real Time PCR反應(yīng)對反應(yīng)特異性要求高。最好選擇應(yīng)用Hot Start DNA聚合酶的試劑。但有一點(diǎn)需要強(qiáng)調(diào)，Hot Start DNA聚合酶有兩種類型，即化學(xué)修飾型和抗體結(jié)合型。
使用這兩種Hot Start DNA聚合酶的PCR反應(yīng)條件不同，使用化學(xué)修飾型Hot Start DNA聚合酶，需要在PCR條件的最初步驟設(shè)置10～15分鐘的熱變性程序，以恢復(fù)DNA聚合酶的活性；而抗體結(jié)合型Hot Start DNA聚合酶，不需要長時(shí)間的熱變性步驟，通常的PCR條件即可恢復(fù)DNA聚合酶的活性，最適合快速PCR反應(yīng)。
f. 所選試劑要與使用的Real Time PCR檢測系統(tǒng)相匹配。最好選擇對各種機(jī)型裝置都顯示良好反應(yīng)性能的試劑。
2. 引物和探針的設(shè)計(jì)。
引物設(shè)計(jì)原則
擴(kuò)增片段大小 |
80-150 bp（盡量限制在300 bp以內(nèi)） |
Primer長度 |
17-25 base |
GC含量 |
40-60%（最好45-55%） |
Tm值 |
兩條引物的Tm值盡量接近，引用專用軟件計(jì)算Tm值 |
序列 |
整體上堿基不能過偏，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端） |
3’末端序列 |
避免GC含量過高，3’末端堿基最好為G或C，盡量避免3’末端堿基為T |
互補(bǔ)性 |
引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3 base以上的互補(bǔ)序列，引物3’末端避免2 base以上的互補(bǔ)序列 |
特異性 |
使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 |
RT-PCR用引物 |
盡量在Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增 |
Probe長度 |
20-24 base |
Tm值 |
探針的Tm比引物高8-10℃ |
| 序列 | 在目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計(jì)，整體上堿基不能過偏，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端) |
5’末端序列 |
探針5’末端的第一個(gè)堿基不能是G |
互補(bǔ)性 |
Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3 base以上的互補(bǔ)序列 |
特異性 |
BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性 |
3. 反應(yīng)條件的優(yōu)化
依據(jù)所使用的產(chǎn)品說明書進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化。
4. 實(shí)驗(yàn)操作
必須分區(qū)操作。通常分為：反應(yīng)液調(diào)制區(qū)；模板添加/樣品制備區(qū)；PCR反應(yīng)區(qū)。
進(jìn)行Real Time PCR首先要確認(rèn)的工作如下：
1. 引物和探針的序列是否有錯(cuò)誤?組合是否正確?
2. Total RNA是否有分解的可能?
3. 各種試劑是否忘記加入?
4. PCR條件和熒光檢出步驟是否設(shè)定正確?
如果有成功反應(yīng)經(jīng)歷的模板（Positive Control），設(shè)置Positive Control反應(yīng)，很容易進(jìn)行以上項(xiàng)目的確認(rèn)。Total RNA一定要通過電泳和OD分析確認(rèn)其質(zhì)量。
有時(shí)Total RNA或cDNA中含有對反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)的阻害物質(zhì)（如RNA提取時(shí)使用的有機(jī)溶劑等）。為了確認(rèn)這樣的阻害物質(zhì)的有無，使用較高濃度的模板按3～4個(gè)梯度稀釋，并使用其進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)或Real Time PCR反應(yīng)。如果無阻害物質(zhì)存在，得到的Ct值會(huì)依存模板濃度的變化而變化；如果有阻害物質(zhì)存在，就會(huì)發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應(yīng)性能下降的現(xiàn)象。
| 擴(kuò)增曲線存在問題時(shí)，首先應(yīng)確認(rèn)基線校正或ROX校正前的原始曲線，擴(kuò)增曲線的熒光信號(hào)值低多數(shù)是由于背景熒光信號(hào)值過高造成的。如下圖所示，A的原始擴(kuò)增曲線背景熒光信號(hào)值約為280，其基線校正后的擴(kuò)增曲線顯示較高的熒光信號(hào)值（約500）；而B的原始擴(kuò)增曲線背景熒光信號(hào)值可達(dá)800，其基線校正后的擴(kuò)增曲線熒光信號(hào)值較低（約150）。使用嵌合熒光法進(jìn)行檢測時(shí)，背景熒光信號(hào)偏高大多數(shù)是由于模板量過高，染料嵌入到初始模板DNA中發(fā)出熒光造成的。使用熒光探針法進(jìn)行檢測時(shí)，背景熒光信號(hào)偏高大多是由于設(shè)計(jì)的探針質(zhì)量差使淬滅基團(tuán)的淬滅作用不充分、報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的搭配不合理、探針的熒光標(biāo)記效率低等原因造成的。 |
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| 背景熒光信號(hào)值確認(rèn)圖例 |
出現(xiàn)這種現(xiàn)象一般有兩種可能，如下圖所示。 |
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| 擴(kuò)增曲線朝右下方下落的解決圖例 |
由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算得到的PCR擴(kuò)增效率低時(shí)，可以考慮以下幾點(diǎn)原因。
1. PCR反應(yīng)性能差。引物、試劑、PCR條件的再摸索。
2. PCR阻害物質(zhì)的混入。模板提取方法的再摸索。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不準(zhǔn)確。使用專用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋Buffer。
稀釋的低濃度標(biāo)準(zhǔn)品常常有易分解不穩(wěn)定的現(xiàn)象產(chǎn)生，所以使用的稀釋液中最好加入與實(shí)驗(yàn)材料不同生物種的tRNA和rRNA以起保護(hù)作用。但偶爾也有因加入的tRNA和rRNA的序列與目的基因序列具有同源性而產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象。如果使用不含tRNA和rRNA的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋專用試劑EASY Dilution（for Real Time PCR）（Code No. 9160），將不會(huì)有這方面的顧慮。
PCR擴(kuò)增效率比理論值偏高，大多是由于反應(yīng)體系中含有PCR阻害物質(zhì)，需要改進(jìn)模板提取方法。另外，使用嵌合熒光法檢測時(shí)，有時(shí)非特異性擴(kuò)增也會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率高，要通過融解曲線分析加以確認(rèn)。
首先懷疑發(fā)生了目的片段以外的擴(kuò)增。
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| 融解曲線分析特例 |
以前，GAPDH，β-actin基因常被作為管家基因使用，但近幾年也常有這些基因因樣品經(jīng)藥物等處理后表達(dá)量發(fā)生變化的報(bào)道。目前，很多研究者認(rèn)為一種管家基因有可能校正不充分，同時(shí)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的復(fù)數(shù)管家基
因進(jìn)行校正更值得信賴。當(dāng)然這種校正方法也是非常耗費(fèi)精力的，通常要選擇若干個(gè)管家基因同時(shí)進(jìn)行表達(dá)量分析，從中選擇表達(dá)量變化幅度小的管家基因來使用，選擇最適校正基因的軟件有很多，請下載利用（geNorm、BestKeeper等）。
【參考文獻(xiàn)】
Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Vandesompele
J,（2002）3（7）: RESEARCH0034.1-11
為了保持與實(shí)際檢測樣品間的擴(kuò)增效率的一致性，作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與實(shí)際檢測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。例如以基因組DNA為起始材料時(shí)就要選擇基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行mRNA表達(dá)解析時(shí)最好選擇表達(dá)目的基因的Total RNA(或以Total RNA為模板合成的cDNA)作為標(biāo)準(zhǔn)品。即使擴(kuò)增堿基序列相同，但整體模板不同，也有可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率不同（比如基因組DNA和質(zhì)粒DNA等）。
Real Time PCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線有2種方法：(1) 從RNA開始稀釋進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和Real Time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作；
(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后得到的cDNA開始稀釋進(jìn)行Real Time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，選擇合適的方法。
［絕對定量］
RNA絕對定量要考慮到反轉(zhuǎn)錄效率，應(yīng)選擇上述方法（1）的標(biāo)準(zhǔn)品。此時(shí)，不推薦使用cDNA稀釋品作為標(biāo)準(zhǔn)品。
［相對定量］
相對定量通常使用管家基因等來測定，可以校正反轉(zhuǎn)錄效率的誤差，推薦選擇上述方法（2）的標(biāo)準(zhǔn)品。如果使用RNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，除了PCR擴(kuò)增效率以外，還要考慮RNA的反轉(zhuǎn)錄效率。如果按此與實(shí)際情況不符的PCR擴(kuò)增效率計(jì)算，可能會(huì)導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果有偏差。
1. 引物設(shè)計(jì)時(shí)避免基因組DNA擴(kuò)增：首選確認(rèn)目的基因的基因組結(jié)構(gòu)，選擇跨越較長的內(nèi)含子。然后在這個(gè)內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子上分別設(shè)計(jì)上、下游引物。
2. 使用DNase I處理去除基因組DNA：使用常規(guī)方法提取Total RNA后，再使用DNase I分解混入的基因組DNA。
3. 使用RR047A PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 附帶的gDNA Eraser可以高效去除殘留的基因組DNA。僅需42℃、2分鐘即可去除基因組DNA。后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需15分鐘。全程反應(yīng)不超過20分鐘。
使用驗(yàn)證過的引物時(shí)，之前的融解曲線分析（Tm值）可作為參考依據(jù)。如果Tm值與過去的驗(yàn)證結(jié)果相同，可以認(rèn)為qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與過去驗(yàn)證結(jié)果相同。
但是，請切記，相同的PCR產(chǎn)物具有相同的Tm值，但僅憑相同的Tm值并不一定可以確認(rèn)PCR產(chǎn)物是相同的。應(yīng)通過另外的方法來確認(rèn)。如果是首次使用該引物，應(yīng)使用電泳方法確認(rèn)qPCR產(chǎn)物是否是預(yù)期的大小。
qPCR的靈敏度取決于實(shí)驗(yàn)條件，如使用的試劑和引物。已經(jīng)證實(shí)合適的反應(yīng)系統(tǒng)可以檢測低至10個(gè)拷貝的模板。
1. 交點(diǎn)法（Crossing point法），是通過閾值和擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)計(jì)算Ct值的方法。
2. 二次求導(dǎo)法（2nd Derivative Maximum法），是通過擴(kuò)增曲線二次求導(dǎo)后取其最大的點(diǎn)計(jì)算Ct值的方法。
后一種方法是以擴(kuò)增速度的變化率最大點(diǎn)計(jì)算Ct值，不會(huì)隨閾值的設(shè)定不同而變化，所以重現(xiàn)性高。另外，還能排除儀器檢出誤差的影響，是一種高準(zhǔn)確度的計(jì)算方法。但是，并不是所有廠家的定量PCR儀器都具有二次求導(dǎo)計(jì)算Ct值的功能。
頁面更新：2020-04-24 13:57:27
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