Takara Bio公司銷售有三種TB Green™ Green Assay用的廣譜型Real Time PCR試劑，這些試劑的反應(yīng)特異性以及擴(kuò)增效率之間有以下關(guān)系。TB Green™ Premix Ex Taq ™ (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR420A/B）是擴(kuò)增效率與反應(yīng)特異性綜合性較好、通用性高的試劑，但是，如果想提高反應(yīng)特異性，使用TB Green™ Premix DimerEraser™（Code No. RR091A/B）和TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B)則更有效。
應(yīng)用二步法RT-PCR進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)時，RT反應(yīng)后，RT反應(yīng)液的加入量不能超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。例如：25 μl PCR反應(yīng)體系中加入的RT反應(yīng)液為1～2.5 μl。
不需要對Mg2+濃度進(jìn)行研討。如果使用本公司設(shè)計(jì)合成的引物或遵循各產(chǎn)品說明書中介紹的引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的引物，按照說明書推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，通常都會得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果得不到良好實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請研討PCR反應(yīng)條件或更換PCR引物等。
本公司「Perfect Real Time」系列產(chǎn)品的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，兩步法PCR可以縮短反應(yīng)時間，增強(qiáng)反應(yīng)特異性，提高擴(kuò)增效率，可以得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以我們推薦設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)閮刹椒≒CR。退火/延伸溫度為60℃，條件優(yōu)化時可在60～66℃范圍內(nèi)研討。避免退火/延伸溫度設(shè)定為68℃，溫度過高引物退火不完全，擴(kuò)增效率下降。如果兩步法PCR反應(yīng)性能較差時，可變更為三步法PCR程序。可參考產(chǎn)品說明書對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。
進(jìn)行擴(kuò)增效率良好的「Perfect Real Time」PCR反應(yīng)，設(shè)計(jì)反應(yīng)性能優(yōu)越的引物非常重要。有時無論怎樣進(jìn)行條件研討，都得不到良好的結(jié)果，此時建議重新設(shè)計(jì)引物。我們在各產(chǎn)品說明書中詳細(xì)介紹了引物設(shè)計(jì)原則，請參考使用。同時，本公司還開設(shè)了Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)合成服務(wù)，詳細(xì)內(nèi)容請參照“Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)合成服務(wù)”部分。如果利用本公司設(shè)計(jì)合成的引物，按照說明書中推薦的標(biāo)準(zhǔn)兩步法PCR程序，通常都會得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，歡迎惠顧本公司 Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)合成服務(wù)。
TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、TB Green DimerEraser和Premix Ex Taq不需要使用這一長時間的變性步驟，請遵照產(chǎn)品說明書的實(shí)驗(yàn)條件要求進(jìn)行PCR反應(yīng)。
有些公司的Premix制品中已經(jīng)加有ROX Reference Dye，所以顏色較深。而TB Green® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus) 和TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) 在制品中沒有添加ROX Reference Dye，但在制品包裝中另外附有，所以TB Green® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus) 、TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) 和TB Green® DimerEraser™顏色較淡。
融解不徹底時，有時會有白色絮狀沉淀物。此時請用手稍微加熱或于室溫短時間放置制品，然后進(jìn)行上下顛倒混合，使制品充分溶解。溶解后的制品性能不會受到影響，但請不要用振蕩器等劇烈攪拌混合。
使用LightCycler2.0儀器，無法檢測到Cy5標(biāo)記的探針中Cy5信號，原因是：
LightCycler 2.0儀器的激發(fā)單元配備的是藍(lán)色發(fā)光二級管LED光源，其最大發(fā)射光的波長為470 nm（納米）。而Cy5的激發(fā)波長為649 nm，不能被藍(lán)色二級管激發(fā)，所以檢測不到任何信號。
Cy5標(biāo)記的探針在ROCHE的LightCycler2.0熒光定量PCR儀上檢測不到信號，是ROCHE儀器本身設(shè)置問題，與探針質(zhì)量沒有關(guān)系。
注意：使用LightCycler2.0熒光定量PCR儀時，探針的報(bào)告基團(tuán)不要使用Cy5標(biāo)記。
是的。FAM屬于對pH敏感的染料，其熒光強(qiáng)度受pH影響較大（特別是在pH5-pH8范圍內(nèi)）。隨著溶液pH值的升高，F(xiàn)AM染料的熒光強(qiáng)度增大（請參見下圖）。
不建議使用未經(jīng)純化的脫鹽引物進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)。在熒光定量實(shí)驗(yàn)中引物的純度很重要，建議使用PAGE或更高純化級別的引物。
頁面更新：2018-10-22 10:41:21
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