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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁(yè) > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問(wèn)答 > Takara > 核酸提取純化及DNA標(biāo)記 > TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0
Q-1：純化質(zhì)粒DNA時(shí)，一般使用多少菌體培養(yǎng)液比較合適?
A-1：

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，如為高拷貝質(zhì)粒（如：pUC118等），使用2 ml培養(yǎng)液與4 ml培養(yǎng)液純化的質(zhì)粒DNA的收量差別不是很大，可以純化10～15 μg高純度質(zhì)粒DNA。我們一般使用2 ml的菌體培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。

Q-2：本試劑盒對(duì)低拷貝質(zhì)粒的純化提取情況如何?
A-2：

對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，使用4 ml的菌體培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取比較合適。如使用pBI121質(zhì)粒時(shí)，從4 ml的菌體培養(yǎng)液中，可以純化提取2～3 μg的高純度質(zhì)粒DNA。若質(zhì)粒量仍不夠可以多次提取后混合使用。

Q-3：質(zhì)粒DNA的收量較低，為什么?
A-3：

一般情況下，從2 ml的LB培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)的pUC118/JM109培養(yǎng)液中，可以純化約10 μg高純度質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA收量較低時(shí)，可以從以下幾個(gè)方面考慮：
① 大腸桿菌太陳舊（低溫下長(zhǎng)期保存的菌等）。請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
② 質(zhì)粒拷貝數(shù)低。使用低拷貝數(shù)載體時(shí)，每次產(chǎn)出的質(zhì)粒DNA量會(huì)降低。
③ 確認(rèn)操作過(guò)程的嚴(yán)密性。應(yīng)嚴(yán)格按操作方法進(jìn)行操作。
④ 洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

Q-4：加入Solution Ⅱ后的溶菌液不澄清，為什么?
A-4：

① 菌體量過(guò)多，不能充分溶菌。使用本試劑盒時(shí)，每次可處理的菌體培養(yǎng)液為1～4 ml，菌體量過(guò)多時(shí)，需要按照比例增加Solution I\II\III的加量。
② 菌體沉淀懸浮不充分。在加入Solution Ⅰ后，應(yīng)使用振蕩器（Vortex）等進(jìn)行劇烈振蕩使菌體沉淀充分懸浮后再做溶菌處理。

Q-5：質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果不佳，為什么?
A-5：

① 模板DNA加量不準(zhǔn)。請(qǐng)對(duì)質(zhì)粒DNA正確定量。使用吸光度值定量時(shí)，有時(shí)DNA溶液中的不純物會(huì)影響吸光度值的測(cè)定，此時(shí)建議使用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量。
② 質(zhì)粒DNA純度不好。請(qǐng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作要求，使用新鮮菌體培養(yǎng)液提取質(zhì)粒。
③ 進(jìn)行DNA洗脫時(shí)用滅菌蒸餾水洗脫。
④ DNA插入片段本身立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜。有些DNA立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如GC rich、重復(fù)序列等）時(shí)難以測(cè)序，應(yīng)改進(jìn)測(cè)序方法。

Q-6：質(zhì)粒DNA的最小洗脫體積是多少?
A-6：

我們建議的洗脫體積為30-100 μl，此種洗脫體積下收率最佳（但要注意洗脫液需直接加至膜中心），低于30 μl時(shí)收率會(huì)有所下降，當(dāng)對(duì)質(zhì)粒DNA濃度要求較高時(shí)，也可以減少洗脫液體積至20 μl，但回收率會(huì)略有下降，應(yīng)注意使用預(yù)熱的洗脫液洗脫，并在洗脫離心之前靜置1分鐘以上，以增加洗脫效率。

Q-7：提取得到的質(zhì)粒有基因組DNA污染，為什么?
A-7：

① 加入Solution II后所有的振蕩要輕柔，不可劇烈；
② 加入Solution II后裂解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，不可超過(guò)5分鐘；
③ 提取的菌體培養(yǎng)時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)12-16小時(shí)為宜。

Q-8：提取得到的質(zhì)粒有RNA污染，為什么?
A-8：

① 確保Solution I中已經(jīng)加入了RNase A；
② 加入RNase A的Solution I應(yīng)于4℃保存，若保存超過(guò)3個(gè)月，RNase A活性會(huì)下降，可以重新額外添加RNase A（Code No．2158）。

頁(yè)面更新：2020-04-28 15:20:04