本試劑盒適合于細菌的基因組DNA提取?；蚪MDNA的提取量根據(jù)細菌不同而各異，一般情況下，從2.0E+09的細菌中，可以提取約5～15 μg的基因組DNA；從2.0E+09的E.coli JM109細胞中，可以提取約10 μg的基因組DNA；從2.0E+09的Staphylococcus aureus 細胞中，可以提取約6 μg的基因組DNA。
基因組DNA收量較低時，可以從以下幾個方面考慮：
1．實驗材料量太少，比如從2.0E+06細菌中提取的基因組DNA是電泳檢測不到的；
2．裂解不充分，DNA未充分釋放。由于各種細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)差異較大，所以裂解條件也有所差異，菌體完全裂解后應(yīng)呈透明、澄清狀，且當(dāng)DNA含量較高時，溶液較粘稠。裂解不充分時，溶液呈渾濁狀，可以適當(dāng)延長Lysozyme（20 mg/ml）作用時間或增加使用量，或增加Buffer GL的使用量；
3．提取的細菌中基因組DNA含量較少，適當(dāng)增加菌體使用量；
4．菌體量過大，裂解困難，按比例適當(dāng)增加Lysozyme、Buffer GL的加量或分成多份進行提取；
5．洗脫時將滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃后使用將有利于提高洗脫效率；
6．請嚴(yán)格按照操作方法進行操作。
提取的基因組DNA有降解，可以從以下幾個方面考慮：
1．細菌不夠新鮮，收集后的細菌未及時處理或未低溫保存。我們建議材料應(yīng)盡量在-80℃保存，運輸過程中亦應(yīng)使用干冰等。
2．材料本身有殘留的DNA酶活性?？梢栽黾右淮蜝uffer WA的清洗操作。
3．如需長期保存提取的DNA，請用Elution Buffer溶出。
提取的基因組DNA中有RNA污染，可以從以下幾個方面考慮：
1．實驗過程中沒有使用RNase A。應(yīng)嚴(yán)格按照實驗操作要求使用RNase A。
2．RNase A可能失活。RNase A盡可能在-20℃下保存，RNase A活性比較穩(wěn)定，一般不易失活。
提取的基因組DNA反應(yīng)性能差，可以從以下幾個方面考慮：
1．提取的基因組DNA中鹽份濃度過高。在使用Buffer WA和Buffer WB進行DNA制備膜的清洗時，請沿Spin Column的管壁四周加入，且加入Buffer WB后室溫靜置5分鐘，有助于徹底清洗掉Column上殘留的鹽離子，這樣有利于提高清洗效果。
2．洗脫液中殘留乙醇，在向Column中加入洗脫液之前，將Column在室溫下靜置2分鐘有助于使Column上殘留的乙醇徹底揮發(fā)，然后再加入洗脫液洗脫。
3．進行DNA洗脫時請一定在膜的中央加入洗脫液，盡量不要沾染Spin Column的管壁四周。
本試劑盒主要用于小量基因組DNA的制備，當(dāng)菌體量超出說明書的要求用量時，可以按比例適當(dāng)增加Lysozyme、Buffer GL及Buffer GB的用量，裂解后分到多個Spin column中進行實驗操作。菌體量最好控制在規(guī)定范圍內(nèi)，否則會影響裂解和收量，如果裂解不充分會堵塞Spin column，造成實驗失敗。
一般情況下LB過夜培養(yǎng)的Escherichia.coli JM109 OD600≈3～4 OD/ml，0.5 ml集菌即可，即菌體起始量2 OD（約1.0～2.0E+09 cells）為宜。菌體起始量不可過多，否則裂解不夠充分會堵塞Spin column，從而導(dǎo)致DNA收量降低。
本試劑盒可以進行絕大多數(shù)革蘭氏陰性和陽性細菌的基因組DNA提取，但是有個別革蘭氏陽性菌（如：Bacillus thuringiensis（蘇云金桿菌）的細胞壁結(jié)構(gòu)比較特殊，裂解較困難，DNA提取量稍少。如果遇到裂解較困難的細菌可先進行液氮研磨等物理破碎方法，然后按照革蘭氏陰性細菌的操作方法進行基因組DNA提取。
頁面更新：2020-04-29 14:54:50
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