pCold DNA是以編碼冷休克蛋白質(zhì)的cspA基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的，包含cspA啟動(dòng)子、5’UTR和編碼cspA蛋白質(zhì)N端的一部分堿基。cspA啟動(dòng)子在37℃也能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但其下游的5’UTR非常不穩(wěn)定，所以不能高效地翻譯。可是當(dāng)溫度從37℃下降到15℃后，5’UTR的結(jié)構(gòu)變得非常穩(wěn)定，翻譯效率提高，在低溫（15℃下蛋白質(zhì)的合成效率非常高1）。
并且，轉(zhuǎn)錄編碼cspA蛋白質(zhì)N端的一部分mRNA，可以優(yōu)先與核糖體結(jié)合進(jìn)行翻譯，而其他mRNA則基本不被翻譯（核糖體捕獲現(xiàn)象，Ribosome trapping）2）如上所述，pColdDNA具備以下特性：cspA啟動(dòng)子在低溫下轉(zhuǎn)錄活性不下降，5’UTR在低溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，核糖體具有捕獲現(xiàn)象，低溫下蛋白質(zhì)仍然可以進(jìn)行有效地表達(dá)。盡管在低溫下表達(dá)蛋白質(zhì)以前也實(shí)現(xiàn)過，但是，具備改進(jìn)特性的pCold DNA是非常適合在低溫條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的獨(dú)特載體。
1）Mitta, M., et al. (1997) Mol. Microbiol., 26, 321-335.
2）Xia, B., et al. (2001)J. Biol. Chem.,276, 35581-35588.
需要研討使用的載體種類、宿主和培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件等。
1) 載體種類變更（pCold I～I(xiàn)V DNA, pCold TF DNA, pCold ProS2 DNA, pCold GST DNA）。N末端帶有TEE序列和His標(biāo)簽，蛋白質(zhì)可能會(huì)被表達(dá)。可溶性標(biāo)簽如TF 、ProS2 或 GST會(huì)有效地促進(jìn)可溶性目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
2) 檢查密碼子的使用頻率。根據(jù)基因不同，有可能會(huì)受到密碼子使用頻率的影響。有時(shí)候使用含有稀有密碼子的商品化大腸桿菌（如RosettaTM2）有利于改善表達(dá)狀況。
3) 預(yù)培養(yǎng)的有無、待表達(dá)克隆子的保存方法也會(huì)對(duì)表達(dá)有影響。(參考Q8)
4) 冷休克基因誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響。某些情況下，誘導(dǎo)過遲會(huì)降低表達(dá)水平，因此，早期誘導(dǎo)可能提高表達(dá)水平。
5) IPTG添加前，培養(yǎng)液需要充分冷卻（標(biāo)準(zhǔn)是15℃，30分鐘以上），IPTG添加后也是15℃培養(yǎng)。
不同目的蛋白質(zhì)的最適培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件各不相同。培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件和使用的大腸桿菌宿主、提取方法等參考以下事項(xiàng)進(jìn)行研討。
1) 變更誘導(dǎo)時(shí)間（從對(duì)數(shù)期初期到末期之間）
2) 變更誘導(dǎo)劑IPTG的濃度（0.1～1.0 mM）
3) 研討誘導(dǎo)后的培養(yǎng)溫度和時(shí)間（通常是15℃、24小時(shí)最合適）
4) 研討宿主大腸桿菌的種類和使用伴侶蛋白。可以利用Chaperone Plasmid Set進(jìn)行伴侶蛋白共表達(dá)，也可以嘗試?yán)媚艽龠M(jìn)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的宿主大腸桿菌（Origami™等）。
5) 變更提取方法。使用商品化的大腸桿菌裂解用試劑，不能充分使其細(xì)胞裂解并釋放蛋白質(zhì)。超聲波處理時(shí)加入0.1～1%的表面活性劑（Octyl Glucoside、NP-40、Triton X-100等）會(huì)比較有效。
6) 變更載體類型。使用帶有可溶性標(biāo)簽如TF的載體，將目的蛋白質(zhì)作為融合蛋白質(zhì)進(jìn)行可溶性表達(dá)，ProS2或GST標(biāo)簽載體也有效。
② 菌體不新鮮。提取用菌體的OD600值超過對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期會(huì)造成提取蛋白質(zhì)的量和質(zhì)發(fā)生變化，一般建議在酵母菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集菌體，進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，此時(shí)效果較佳。
從數(shù)kDa到100 kDa的蛋白質(zhì)都可以獲得表達(dá)。
有大腸桿菌、嗜熱菌、超嗜熱菌、人、小鼠和植物等。
pCold I、II、III DNA有TEE序列，可以促進(jìn)蛋白翻譯。同時(shí)，如果使用含有His標(biāo)簽的載體（pCold I、II DNA）,就能夠使用鎳柱純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。如果不希望目的蛋白質(zhì)N末端有附加的氨基酸序列，可以利用Factor Xa切斷標(biāo)簽序列，此時(shí)可以選擇用pCold I DNA，或者推薦使用沒有TEE序列和His標(biāo)簽的質(zhì)粒pCold IV DNA。
使用pCold I-IV DNA表達(dá)目的蛋白，出現(xiàn)目的蛋白不表達(dá)或者是不可溶性表達(dá)時(shí)，推薦使用可以表達(dá)可溶性標(biāo)簽的融合載體，pCold TF DNA、pCold ProS2 DNA或pCold GST DNA。
根據(jù)目的基因的不同，通常能有幾mg～幾十mg/L的表達(dá)量。進(jìn)行小規(guī)模表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，利用粗提液進(jìn)行SDS電泳，然后通過CBB染色確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，3 L培養(yǎng)液可以精制回收mg級(jí)的蛋白質(zhì)。
不推薦4℃保存平板。插入目的基因的pCold DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，如果平板4℃保存，有可能導(dǎo)致細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)的背景表達(dá)。應(yīng)當(dāng)盡早制備成甘油保存樣，然后-80℃保存。
使用pCold DNA表達(dá)系統(tǒng)與含tig序列的伴侶蛋白進(jìn)行共表達(dá)，可獲得好的表達(dá)結(jié)果。首先，推薦與pG-Tf2或者pTf16共表達(dá)進(jìn)行研討。
OD600的值根據(jù)大腸桿菌菌株和插入目的基因的種類不同有所差異。使用BL21作為宿主時(shí)，OD600大約在1.2左右。
使用過的宿主是大腸桿菌BL21。Merck Millipore公司的Origami™、Rosetta™等都可以使用。pCold DNA使用大腸桿菌由來的cspA啟動(dòng)子，大部分的大腸桿菌宿主都可以使用，不過，首先推薦使用BL21。
因?yàn)閜Cold DNA使用冷休克蛋白的啟動(dòng)子，原本目的蛋白質(zhì)在37℃很少是表達(dá)的。但是有些插入片段會(huì)產(chǎn)生微量的背景表達(dá)，所以應(yīng)用了lac operon作為輔助性的調(diào)控系統(tǒng)。
對(duì)于pET載體來說，因?yàn)楸磉_(dá)的調(diào)控只由IPTG的添加來控制，在IPTG還沒有添加時(shí)，表達(dá)是否得到控制成為一個(gè)重要的問題。另一方面，pCold DNA是通過溫度變化調(diào)控誘導(dǎo)，當(dāng)溫度換成低溫后，對(duì)于是否依賴于lac operon的調(diào)控，就不重要了。盡管如此，添加IPTG仍是有必要的，因?yàn)槿魏我环N調(diào)控都有可能有不適合的情況。
lac operator調(diào)控的強(qiáng)度也隨使用宿主大腸桿菌的不同而變化。JM109等有l(wèi)ac Iq進(jìn)行調(diào)控、BL21等有大腸桿菌自有的lac I進(jìn)行調(diào)控，它們調(diào)控的強(qiáng)度有所不同。但是，當(dāng)換成低溫后，調(diào)控強(qiáng)度就不是那么重要了，不需要特異選擇lac Iq的菌株。
采用含有His標(biāo)簽的載體pCold I DNA或pCold II DNA，使用His標(biāo)簽特異性的親和樹脂純化目的蛋白質(zhì)，去除伴侶蛋白。
應(yīng)盡快把溫度從37℃降到15℃。例如：建議把培養(yǎng)容器浸入冰水混合液中，將溫度降到15℃。當(dāng)溫度降到15℃以后，繼續(xù)保持培養(yǎng)液在15℃ 30分鐘以上。尤其對(duì)于大體積的培養(yǎng)容器，要保證整個(gè)培養(yǎng)溶液的溫度是均勻的。
建議使用In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech)。In-Fusion® HD Cloning Kit能夠在15分鐘內(nèi)，定向、無縫隙地把任何PCR片段插入到任何線性載體質(zhì)粒中。In-Fusion® HD Cloning Kit采用15 bp的重疊序列高效地把PCR片段插入到線性的質(zhì)粒載體中。這15 bp的重疊序列可以通過引物設(shè)計(jì)加入到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。
使用TALON® Metal Affinity Resin (Clontech)。TALON® 是帶有鈷離子的金屬親和樹脂，對(duì)帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)具有高度的親和性。因此，TALON® 能夠?qū)в蠬is標(biāo)簽的蛋白質(zhì)進(jìn)行高度純化。另外，建議使用His60 Ni Superflow™ Resin (Clontech)，由于吸附量高（60 mg/ml of His Tag-fused protein)，可一步完成蛋白質(zhì)純化。
據(jù)報(bào)道，GroEL (約60 kDa)、GroES (約10 kDa)、DnaK (約70 kDa)、DnaJ (約40 kDa)、Tf (約56 kDa)、GrpE (約22 kDa)，但與實(shí)際的電泳結(jié)果稍有差別。已確認(rèn)GrpE電泳帶在Marker 29 kDa電泳帶的上方。
伴侶蛋白質(zhì)粒圖譜：
表達(dá)的目的蛋白質(zhì)通常是利用His Tag等親和層析法精制，非常方便。
利用GST Tag精制時(shí)，精制產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，有時(shí)會(huì)看到伴侶蛋白質(zhì)條帶的存在。一般認(rèn)為這是由于伴侶蛋白質(zhì)與谷光甘肽樹脂發(fā)生了非特異性吸附而造成的殘留，進(jìn)而與目的蛋白質(zhì)一同被洗脫下來。
上述情況發(fā)生時(shí)，有報(bào)道稱采用以下方法可以使精制效果得到改善。
· 用離子交換樹脂分離。[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995),92,1048]
· 以ATP-Agarose為基質(zhì)分離。[J.Biol.Chem.(1984),259,8820]
· 將吸附有融合蛋白質(zhì)的樹脂，用含3 mM Mg-ATP的Buffer洗凈。
· 將吸附有融合蛋白質(zhì)的樹脂，在含10 mM Mg-ATP、5 mg/ml casein的Buffer中，室溫保溫20-40分鐘。
目的蛋白質(zhì)的合成與目的基因的來源、序列、RNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有很大關(guān)系。
除此之外，操作過程中引起合成量低下主要有以下幾方面原因。
a. 反應(yīng)液混合不均勻。
→ Cell Lysate粘性較大，反應(yīng)液配制時(shí)要輕柔且充分混合均勻。
b. 制備的質(zhì)粒含有高濃度的核酸酶。
→ 進(jìn)行苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。乙醇清洗要充分，注意不能殘留苯酚。
c. 質(zhì)粒純度低。
→ 進(jìn)行苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。乙醇清洗要充分，注意不能殘留苯酚。
d. 質(zhì)粒濃度低。
→ 乙醇沉淀進(jìn)行濃縮。
e. 試劑保存不當(dāng)。
→ 請(qǐng)保存于適當(dāng)?shù)臏囟取?
請(qǐng)參考以下內(nèi)容：
a. 反應(yīng)液混合不均勻。
→ Cell Lysate粘性較大，反應(yīng)液配制時(shí)要輕柔且充分混合均勻。
b. 試劑保存不當(dāng)。
→ 請(qǐng)保存于適當(dāng)?shù)臏囟取?
在復(fù)性的過程中，CA與表面活性劑形成絡(luò)合物（白色凝乳沉淀）。離心后，上清液中的復(fù)性蛋白質(zhì)與絡(luò)合物分開，但在保存過程中上清液中殘留的CA和表面活性劑還會(huì)形成沉淀物。在這種情況下，請(qǐng)?jiān)俅坞x心除去沉淀物。這一操作不影響復(fù)性的蛋白質(zhì)。
通常，作為復(fù)性蛋白質(zhì)收集的上清液，可以直接用于活性檢測(cè)。如果該蛋白質(zhì)的活性測(cè)定有困難，可以通過SDS-PAGE電泳確定蛋白質(zhì)的大小來判斷蛋白質(zhì)復(fù)性的結(jié)果。使用標(biāo)簽序列例如His-Tag或GST-Tag融合的重組蛋白質(zhì)可以利用標(biāo)簽進(jìn)行柱層析純化。
通常，復(fù)性的蛋白質(zhì)溶液離心后得到的上清液可直接用于活性測(cè)定，如酶活性。當(dāng)活性測(cè)定困難時(shí)，可使用SDS-PAGE。通過檢測(cè)蛋白質(zhì)的大小來判斷復(fù)性是否成功。在重組蛋白質(zhì)帶有標(biāo)簽(例如His-Tag 或GST-Tag)時(shí)，通常利用標(biāo)簽進(jìn)行純化。
可以使用Refolding CA Large Kit（Code No. 7351）。
頁面更新：2018-07-27 11:10:19
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