根據我們的經驗，如為高拷貝質粒（如：pUC19等），使用100 ml培養(yǎng)液，可以純化得到約200 μg高純度質粒DNA。
對于低拷貝質粒，使用100～200 ml的菌體培養(yǎng)液進行質粒DNA的提取比較合適。如使用pBR322質粒時，從100 ml的菌體培養(yǎng)液中，可以純化提取約50 μg的高純度質粒DNA。若質粒量仍不夠，可以多次提取后混合使用。
質粒DNA收量較低時，可以從以下幾個方面考慮：
1. 大腸桿菌太陳舊（低溫下長期保存的菌等）。請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
2. 質?？截悢档汀Ｊ褂玫涂截悢递d體時，每次產出的質粒DNA量會降低。
3. 確認操作過程的嚴密性。應嚴格按操作方法進行操作。
4. 洗脫時將Buffer PE加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。
5. 菌體量過多，裂解不充分，建議起始菌體量不得超過建議起始量。菌體量過多時，需要按照0.02 ml/OD600比例增加Buffer P1/P2/P3的加量，如菌體總量OD600=400時，Buffer P1/P2/P3的加量應為400 OD600*0.02 ml/OD600=8 ml。
6. 檢查使用buffer pH是否改變， Buffer PW1（pH6.3）、Buffer PW2（pH7.0）、Buffer PE（pH9.5），若上述buffer pH發(fā)生變化，可以使用HCl或NaOH進行pH調節(jié)。
A-4：
裂解液Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3可以使用如下溶液代替：
1. Solution Ⅰ：25 mM Tris-HCl（pH8.0）、10 mM EDTA（pH8.0），100 μg/ml RNase A;
2. Solution Ⅱ：0.2 M NaOH、1%（w/v）SDS；
3. Solution Ⅲ：5 M 乙酸鉀 60 ml、冰乙酸 11.5 ml、H2O 28.5 ml，混合均勻后備用。
可參考《分子克隆實驗指南》（第三版）附錄1中堿裂解液Ⅰ、堿裂解液Ⅱ、堿性裂解液Ⅲ配制方法。
1. 菌體量過多，不能充分溶菌。使用本試劑盒時，每次可處理的菌體培養(yǎng)液為25～200 ml，超過此范圍時，應按比例增加裂解液的用量。
2. 菌體沉淀懸浮不充分。在加入Buffer P1后，應使用振蕩器（Vortex）等進行劇烈振蕩使菌體沉淀充分懸浮后再做溶菌處理。
我們建議的溶解體積為200～1000 μl，請根據需要選擇。
1. 加入Buffer P2后所有的振蕩要輕柔，不可劇烈；
2. 加入Buffer P2后裂解時間不宜過長，不可超過5分鐘；
3. 菌體培養(yǎng)時間不可過長，培養(yǎng)12～16小時為宜。
1. 確保Buffer P1中已經加入了RNase A；
2. 加入RNase A的Buffer P1應于4℃保存，若保存超過3個月，RNase A活性會下降，可以重新再添加RNase A（Code No. 2158）。
可考慮以下幾種原因：
1. 加入Buffer P2后操作時間過長，不得超過5分鐘。
2. 確保第二次加入Buffer PW1（即操作步驟10）前已將MidiEF DNA Column中的Filter移除。
3. 確保Buffer PW1、Buffer PW2添加順序和添加量正確。
可考慮以下幾種原因：
1. 質粒DNA貼附于離心管壁，呈透明狀，不容易觀察到，此時溶解DNA時應旋轉離心管，使溶解buffer充分接觸管壁。
2. 確保異丙醇的添加量符合要求，即0.7倍體積。
3. 處理時應小心操作，棄上清時不要將沉淀丟失。
4. 必要時提高離心轉速，增加離心時間。
可考慮以下幾種原因及改善方法：
1. 沉淀干燥過度?？梢試L試將樣品置于37℃條件下溫浴2小時以改善溶解效果。
2. 沉淀中包含鹽類或殘留乙醇。使用70%乙醇再次清洗，或增加溶解buffer的量。
可考慮以下幾種原因：
1. 菌體起始量過多，建議減少菌體起始量。
2. 確認Buffer PW1、Buffer PW2添加量及添加順序是否正確。
3. 操作過程導致污染。確保操作中使用的離心管、移液管、玻璃器皿等器具滿足無熱原或無內毒素要求，確保使用的70%乙醇及溶解質粒DNA的buffer未被污染。
頁面更新：2019-04-25 13:53:27
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