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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁 > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問答 > Clontech > NGS相關(guān)制品問答 > ThruPLEX® DNA-Seq Kit
Q-1：ThruPLEX DNA-Seq Kit與其他公司的文庫制備試劑盒有何不同？
A-1：

ThruPLEX DNA-Seq Kit是更快速和靈敏度更高的文庫制備試劑盒。整個(gè)操作包含end-repair，ligation，amplification 3步反應(yīng)，且在單管中進(jìn)行反應(yīng)。
· Input DNA量：50 pg～50 ng
· 純化步驟：中間不需要（僅文庫擴(kuò)增后）
· 文庫制備步驟數(shù)：3
· 文庫制備的時(shí)間：2h
· sample轉(zhuǎn)管次數(shù)：0

Q-2：ThruPLEX DNA-Seq Kit對于GC Rich的區(qū)域也能實(shí)現(xiàn)均一覆蓋嗎?
A-2：

可以。ThruPLEX DNA-Seq Kit對于GC Rich的區(qū)域也能實(shí)現(xiàn)均一覆蓋。

Q-3：ThruPLEX DNA-Seq Kit是否可以用于變性/單鏈DNA?
A-3：

不可以。ThruPLEX DNA-Seq Kit必須使用雙鏈DNA。

Q-4：DNA是否需要片段化？
A-4：

需要。DNA長度＞1 kb時(shí)，使用ThruPLEX DNA-Seq Kit前需進(jìn)行片段化。

Q-5：DNA片段化可以使用哪些方法？
A-5：

DNA片段化可以使用物理方法（Covaris、Bioruptor等）或酶切方法（DNA Fragmentation Kit等）的方法。

Q-6：使用Covaris進(jìn)行片段化時(shí)，DNA的加量是多少？另外，片段化使用的緩沖液種類有哪些？
A-6：

在50-130 μl 的TE 或Low-TE緩沖液中加入2-50 ng DNA即可成功完成片段化過程。使用更少量DNA時(shí)，可以參考“Low-volume DNA shearing for ThruPLEX library prep”。

Q-7：使用Covaris進(jìn)行片段化時(shí)，如何設(shè)置反應(yīng)條件？
A-7：

Covaris的推薦條件需要根據(jù)所需片段大小進(jìn)行設(shè)定。詳細(xì)請參考Covaris網(wǎng)頁內(nèi)容。

Q-8：是否有將ThruPLEX DNA-Seq Kit中使用的gDNA片段化的試劑盒？
A-8：

可以使用將gDNA隨機(jī)片段化的DNA Fragmentation Kit（Code No. 6137）。使用方法請參考DNA Fragmentation Kit的說明書。

Q-9：推薦用于ThruPLEX DNA-Seq Kit的DNA起始量是多少？
A-9：

ThruPLEX DNA-Seq Kit設(shè)計(jì)用于以50 pg～50 ng DNA起始的擴(kuò)增。 起始量取決于所需的多樣性水平和用途。

Q-10：必須使用Indexing kit嗎？Multiplex分析時(shí)使用哪些index比較好？
A-10：

是的。需要另購Indexing kit。Indexing kit以tube或microplate方式提供，含有對應(yīng)Illumina公司NGS用index序列形成的擴(kuò)增引物，用于ThruPLEX DNA-Seq文庫擴(kuò)增。

Q-11：推薦使用哪些方法確定文庫擴(kuò)增反應(yīng)所需的適宜PCR循環(huán)數(shù)？
A-11：

關(guān)于文庫擴(kuò)增適宜PCR循環(huán)數(shù)的選擇，請參考ThruPLEX DNA-Seq Kit的操作說明書。

Q-12：沒有Real Time PCR儀是否可以使用ThruPLEX DNA-Seq Kit？如果可以，如何確定PCR循環(huán)數(shù)？
A-12：

可以。ThruPLEX DNA-Seq Kit在沒有Real Time PCR儀時(shí)也可以使用。適宜PCR循環(huán)數(shù)請參考ThruPLEX DNA-Seq Kit說明書，根據(jù)使用的DNA起始量進(jìn)行選擇。

Q-13：ThruPLEX DNA-Seq Kit制備的文庫，如果濃度或收量不夠的話是否可以追加擴(kuò)增？
A-13：

可以。 ThruPLEX DNA-Seq文庫，4℃最多保存6小時(shí)或-20℃最多保存7天后，不需要添加試劑可再進(jìn)行追加擴(kuò)增。關(guān)于文庫處理流程，追加循環(huán)數(shù)的順序及流程請參考ThruPLEX DNA-Seq Kit說明書。

Q-14：ThruPLEX DNA-Seq文庫使用AMPure XP beads純化后是否可以追加擴(kuò)增？
A-14：

不可以

Q-15：ThruPLEX DNA-Seq Kit制備好的文庫產(chǎn)量的預(yù)期是多少？
A-15：

預(yù)期產(chǎn)量為100 ng～1 μg。文庫的產(chǎn)量隨樣品的種類、片段大小、使用的Thermal cycler等不同而不同。Covaris片段化后平均大小為200 bp的reference DNA，按照推薦的循環(huán)數(shù)擴(kuò)增后，一般產(chǎn)量為300 ng～700 ng。

Q-16：AMPure XP純化前后是否需要對ThruPLEX DNA-Seq文庫進(jìn)行定量？
A-16：

不需要。僅在測序前對單個(gè)或pooling之后的文庫進(jìn)行定量。文庫擴(kuò)增后，如果要進(jìn)行文庫定量需要增加AMPure XP純化步驟，增加純化操作可能會造成DNA損失，因此建議只對測序前的純化文庫進(jìn)行定量。

Q-17：使用ThruPLEX DNA-Seq Kit制備的文庫經(jīng)AMPure XP純化時(shí)，是否有需要特別注意的事項(xiàng)？
A-17：

是的。建議Beads：Sample比例為1：1。所有清洗步驟用到的80%乙醇需要現(xiàn)用現(xiàn)配。詳細(xì)說明請參考ThruPLEX DNA-Seq Kit操作說明書。

Q-18：使用ThruPLEX DNA-Seq Kit制備的文庫，測序時(shí)可以使用哪些Illumina平臺？
A-18：

ThruPLEX DNA-Seq Kit制備的文庫，適用于所有Illumina平臺，包括HiSeq®, MiSeq®, NextSeq® 500, GAIIx™, NovaSeq™，和MiniSeq™。

Q-19：添加到Flow cell中的ThruPLEX DNA-Seq文庫的濃度是多少？
A-19：

Flow cell中添加的樣品濃度，請參照Illumina的推薦值。使用Illumina MiSeq® v3測序時(shí)，推薦添加14～15 pM的ThruPLEX DNA-Seq文庫。

Q-20：ThruPLEX DNA-Seq文庫添加到Flow cell中時(shí)，是否需要特殊的操作？
A-20：

不需要特殊的操作。ThruPLEX DNA-Seq文庫的處理方法與TruSeq Nano DNA HT Sample Prep kit等Illumina文庫制備試劑盒是相同的。

Q-21：添加到Flow cell前，是否需要在文庫中加入PhiX？
A-21：

請參考Illumina公司的PhiX使用方法。對于多樣性低的文庫或者測序會遇到問題的文庫，可能需要增加PhiX濃度。請參閱ThruPLEX DNA-Seq Kit說明書了解更多的測序建議。

頁面更新：2020-04-15 15:14:48