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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁 > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問答 > Clontech > In-Fusion Cloning 常見問答 > 引物設(shè)計(jì)
Q-1：同源序列只能附加15 bp嗎？
A-1：

   經(jīng)過驗(yàn)證，同源序列少于12個堿基或者多于20個堿基克隆效率都會明顯降低。因此推薦附加15 bp
   同源堿基序列。

Q-2：15 bp同源序列是必須與線性化載體末端完全契合還是可以錯開幾個堿基？
A-2：

   15 bp同源序列必須與線性化載體最末端的15 bp完全相同（更多信息請參考操作手冊）。如果
   15 bp同源序列錯開幾個堿基，In-Fusion反應(yīng)可能也可以起作用，但是在Clontech沒有進(jìn)行驗(yàn)證。

Q-3：In-Fusion PCR引物可以包含除了15 bp 同源序列和目的基因序列以外的其它序列嗎？
A-3：

   是的。例如，在15 bp同源序列和目的基因序列之間引入Kozak序列(CCACC)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會受到
   任何影響。同樣也可以包含限制性酶切位點(diǎn)或者融合標(biāo)簽。PCR引物按順序應(yīng)該包含以下序列
   (listed 5' to 3'): 15 bp同源序列，Kozak序列或者限制性酶切位點(diǎn)，目的基因序列。

Q-4：In-Fusion克隆會改變閱讀框嗎？
A-4：

   閱讀框是由引物序列來決定的。例如，創(chuàng)建一個融合蛋白質(zhì)時，如果引物中15 bp同源序列對應(yīng)于
   第一個目的基因的最后5個密碼子，那么您需要將第二個目的基因起始密碼子放置在同源序列的最
   后一個密碼子之后（也即是同源序列的3'端），以保證第二個目的基因與第一個目的基因在同一個
   讀碼框內(nèi)。如果讀碼框發(fā)生滑動的話，您可以在15 bp 同源序列之后和目的基因第一個密碼子之前
   簡單添加1-2個額外堿基就可以。

Q-5：對于In-Fusion克隆反應(yīng)，15 bp同源序列區(qū)域在載體上不止出現(xiàn)一次會有影響嗎？這樣會產(chǎn)生多種重組結(jié)果嗎？
A-5：

   在載體內(nèi)部而不是在臨近載體線性化的位點(diǎn)發(fā)生重組事件的概率極低。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們采用
   Sal I和Hind III雙酶切pDNR-Dual載體。這樣，In-Fusion PCR引物的15 bp同源序列始終包含編碼
   loxP位點(diǎn)的序列。盡管pDNR-Dual在氯霉素抗性基因的兩側(cè)有兩個loxP位點(diǎn)，只有不到1%的克隆
   發(fā)生了錯誤。因此，即使同源序列在載體序列上出現(xiàn)多次，錯誤重組事件發(fā)生的可能性也非常小。

Q-6：當(dāng)兩個PCR產(chǎn)物（PCR擴(kuò)增獲得的載體和插入片段）進(jìn)行In-Fusion連接時，需要合成帶有5‘磷酸基團(tuán)的引物嗎？
A-6：

   答案是否定的，In-Fusion克隆反應(yīng)并不依賴于5'磷酸基團(tuán)，因此采用常規(guī)的引物擴(kuò)增得到的兩個
   PCR產(chǎn)物即可進(jìn)行有效的In-Fusion克隆反應(yīng)。

Q-7：In-Fusion PCR引物的純度要求是什么？
A-7：

   脫鹽處理獲得的引物即可滿足In-Fusion有效克隆的高質(zhì)量要求。無需進(jìn)行膠純化或者HPLC純化。

Q-8：任何載體都適用于In-Fusion反應(yīng)嗎?
A-8：

   是的，任何載體均適用。經(jīng)過驗(yàn)證In-Fusion酶可以有效作用于多種載體類型。我們將 2.5 kb的
   PCR片段成功克隆到了33 kb的腺病毒載體中。值得注意的是，大載體(>10 kb)的克隆效率會有
   所下降。

Q-9：進(jìn)行In-Fusion 克隆反應(yīng)的載體必須是線性化的嗎？線性化方法是什么？
A-9：

   是的，所需載體必須是線性化的。進(jìn)行In-Fusion克隆反應(yīng)的線性化載體可以通過酶切處理（單酶
   切或者雙酶切）的方式獲得，也可以通過反向PCR擴(kuò)增獲得。In-Fusion反應(yīng)不依賴于5’磷酸基
   團(tuán)，因此只要擁有15 bp同源序列，即使是沒有經(jīng)過修飾的兩個PCR產(chǎn)物也可以連接在一起。

Q-10：載體線性化最為有效的方法是什么?
A-10：

    我們建議采用雙酶切而不是單酶切方法處理載體，以最大限度減少載體自連產(chǎn)生的背景。在限制
    性內(nèi)切酶不產(chǎn)生星活性的前提條件下，建議酶切時間為3-24小時。反向PCR擴(kuò)增載體片段，然后
    采用Cloning Enhancer進(jìn)行純化處理，這也是一個非常有效的載體線性化的方法。

頁面更新：2015-01-06 10:01:36