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機(jī)構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

當(dāng)前位置：首頁(yè) > 技術(shù)資料 > 相關(guān)問答 > Clontech > In-Fusion Cloning 常見問答 > 載體&插入片段制備
Q-1：獲得的線性化載體建議或者需要進(jìn)行去磷酸化處理嗎?
A-1：

   In-Fusion克隆無(wú)需去磷酸化處理線性化載體。去磷酸化處理并不有利于克隆過程，同時(shí)對(duì)DNA末端
   有損傷作用，因此不建議進(jìn)行去磷酸化處理。

Q-2：由Taq聚合酶導(dǎo)入的A-尾會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行In-Fusion反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生影響嗎？
A-2：

   A-尾不會(huì)影響In-Fusion克隆反應(yīng)的進(jìn)行以及所克隆基因的讀碼框。
   注意：我們建議您使用高保真PCR擴(kuò)增酶而不使用Taq聚合酶，以確保PCR產(chǎn)物的正確性。

Q-3：采用PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效地In-Fusion克隆必須進(jìn)行膠純化嗎？
A-3：

   不是。如果PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示為單一清晰的條帶（例如無(wú)背景條帶或者彌散現(xiàn)象），您
   也可以采用Cloning Enhancer處理PCR產(chǎn)物而無(wú)需進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理，或者采用離心柱進(jìn)行純
   化。如果PCR產(chǎn)物小于350 bp，我們建議采用Cloning Enhancer進(jìn)行處理以減少樣品損失。
   如果PCR產(chǎn)物包含非特異性背景條帶則應(yīng)該采用膠純化方式分離純化目的片段。對(duì)于In-Fusion克
   隆，我們推薦采用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

Q-4：In-Fusion系統(tǒng)適用的的插入片段的大小范圍是多少？
A-4：

   載體和插入的DNA片段即使超過10 kb也可以進(jìn)行連接反應(yīng)，只是連接效率會(huì)有所降低。In-Fusion
   系統(tǒng)最長(zhǎng)可以克隆15 kb的DNA片段，8-15 kb的克隆效率會(huì)有所降低。插入的DNA片段只要不少于
   50 bp就可進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。

Q-5：In-Fusion可以克隆的最大的載體大小是多少？
A-5：

   In-Fusion可以克隆的最大的載體大小為46 kb。

Q-6：Cloning Enhance的作用是什么？
A-6：

   Cloning Enhance用于移除模板DNA背景和PCR殘留，當(dāng)PCR產(chǎn)物單一時(shí)（例如沒有背景的情況
   下）無(wú)需在克隆前對(duì)插入片段進(jìn)行膠純化處理。

Q-7：建立In-Fusion反應(yīng)體系時(shí)，線性化載體和插入片段的摩爾比例關(guān)系是多少？
A-7：

   推薦插入片段和線性化載體的摩爾比例關(guān)系為2:1。當(dāng)插入片段介于100-300 bp之間時(shí)，推薦摩爾
   比例為5:1或者10:1，當(dāng)插入片段小于100 bp而大于50 bp時(shí)，推薦摩爾比例為10:1或者50:1。

頁(yè)面更新：2015-01-06 10:17:55