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機構(gòu)用戶解決方案

產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

Q-1：采用超過操作手冊推薦的的In-Fusion反應(yīng)液用量轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞可以獲得更多的克隆嗎？
A-1：

   答案是否定的。大量的In-Fusion酶對于某些大腸桿菌菌株來說是有毒性作用的，因此不建議采用超
   過推薦用量來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。如果需要更多的克隆，我們建議進行多重轉(zhuǎn)化。

Q-2：在單次In-Fusion反應(yīng)中，陰性對照可以獲得多少克??？
A-2：

   試劑盒中提供的陰性對照通常會產(chǎn)生少于5個的藍斑；白斑的數(shù)量根據(jù)使用菌株的不同而有所不同。
   通常情況下，實驗組平板上背景比例大概不到5%。我們猜測背景是由于細胞自身的重組功能所產(chǎn)
   生的，某些E.coli菌株（即使是recA1突變的菌株）也可以產(chǎn)生低水平的同源重組事件（遠遠低于
   In-Fusion酶的重組概率）。這與我們觀察到的實驗平板上98%的克隆是正確的這一點是一致的。

Q-3：如何提高轉(zhuǎn)化效率和整體克隆效率？
A-3：

  • 采用轉(zhuǎn)化效率超過108 cfu/μg的高效感受態(tài)細胞。大多數(shù)自制的感受態(tài)細胞效率相對較低，尤其
    是使用前儲存過一段時間的感受態(tài)細胞。我們推薦采用針對In-Fusion優(yōu)化的Stellar™ Competent
    Cells (Code No. 636763)。
  • 擴增后的PCR片段必須經(jīng)過純化操作以去除dNTPs。
  • 如果您使用的不是商業(yè)化的純化試劑盒，膠純化后應(yīng)該進行酚氯仿抽提以移除雜質(zhì)。
  • 合成高質(zhì)量的引物確保同源序列部分是正確的。

Q-4：In-Fusion克隆不建議使用的感受態(tài)細胞有哪些？
A-4：

   不推薦使用的感受態(tài)細胞為TOP10或者其衍生類細胞（比如ccdB Survival™ 2 T1R E. coli），
   以及其它相關(guān)菌株（DH10B, MC1061）。原因是在這些細胞中In-Fusion連接產(chǎn)物可能存在不穩(wěn)定
   性（或者可能發(fā)生基因重排）。同樣，其他不適用于不穩(wěn)定DNA克隆的感受態(tài)細胞也不推薦使用。

頁面更新：2015-01-06 10:23:35